Exibição de Fagos e NGS: Como o Sequenciamento de Nova Geração Melhora as Bibliotecas de Fagos

Exibição de fago serve como uma tecnologia fundamental na descoberta de fármacos e na engenharia de proteínas, permitindo a triagem de peptídeos funcionais, anticorpos e variantes de proteínas em diversos repertórios genéticos. Esta abordagem baseia-se na construção de bibliotecas com uma diversidade de sequências excecional, tipicamente superior a 10^11 variantes únicas.

Os métodos tradicionais de triagem enfrentam limitações significativas ao lidar com tal complexidade. A composição da biblioteca permanece opaca, a dinâmica de enriquecimento do clone-alvo é mal resolvida e os resultados dependem fortemente de uma validação monoclonal trabalhosa. Essas restrições criam processos de seleção ineficientes e parcialmente cegos.

Sequenciação de próxima geração (NGS) transforma este paradigma através de sequenciação profunda de alto rendimento e custo-efetivo. A sua capacidade de escanear rapidamente o espaço de sequências revolucionou os fluxos de trabalho de exibição de fago.

A Solução NGS: Uma Plataforma Multi-Ferramenta

1. Controlo Total de Qualidade (CTQ) através de NGS

• Tecnologia: Substitui o sequenciamento Sanger de baixo rendimento por Sequenciamento em Paralelo Massivo (NGS) para analisar milhões de partículas de fago.
• Avanço: Alcança um perfil global e abrangente da composição das bibliotecas, superando em muito a escala dos métodos tradicionais.
• Avaliações de Qualidade Fundamental:
  • Diversidade Funcional: Quantifica o número de clones efetivos reais.
  • Cobertura de Design: Avalia se todas as combinações de mutações projetadas estão adequadamente representadas.
  • Diagnóstico de Preferências do Sistema: Identifica preconceitos da construção (por exemplo, ligadura ineficiente, perda de sequência, depleção de sequência tóxica).
• Integridade do Quadro de Leitura: Garante quadros de leitura abertos corretos sem códon de paragem.
• Benefício: Permite a deteção precoce de bibliotecas defeituosas, orientando a otimização de parâmetros e estratégias para melhorar a funcionalidade e representatividade, conservando assim recursos.

2. Monitorização em Tempo Real do Processo de Triagem

• Transformação: Converte a triagem tradicional "caixa preta" num processo dinamicamente rastreável e observável.
• Método: Envolve sequenciação profunda da biblioteca antes e depois de cada ronda (ligação, lavagem, eluição, amplificação) para fornecer uma visão a nível molecular.
• Capacidades:
  • Acompanha as alterações de frequência de clones individuais ao longo das rondas de triagem.
  • Identifica diretamente sequências enriquecidas ou empobrecidas por pressão de seleção.
  • Descobre resíduos, domínios ou motivos de ligação conservados através de alinhamento em múltiplas rondas.
• Função Diagnóstica: Os dados servem como uma ferramenta de diagnóstico (por exemplo, platôs de enriquecimento sugerem condições excessivamente rigorosas; a perda de diversidade indica viés de amplificação).
• Benefício: Permite ajustes em tempo real, baseados em dados, na estratégia de triagem (por exemplo, otimizando a rigidez, ajustando a entrada) para melhorar significativamente a eficiência e as taxas de sucesso.

3. Descoberta Direta de Moléculas Candidatas

• Cronometragem: Nas rondas de triagem posteriores (tipicamente 2-4), os dados de NGS revelam claramente os clones mais enriquecidos e as famílias de sequências dominantes.
• Ganho de Eficiência: Elimina completamente os passos tradicionais demorados de seleção aleatória, cultura e sequenciação Sanger de centenas de clones.
• Fluxo de trabalho:
  • Selecione as principais sequências candidatas com base na classificação de enriquecimento NGS e dados de integridade.
  • Sintetizar oligonucleotídeos para expressão rápida de proteínas recombinantes.
  • Valide rapidamente os candidatos utilizando técnicas de alto rendimento (por exemplo, ELISA, SPR, ensaios funcionais).
• Benefício Principal: Comprime drasticamente o cronograma desde o final da triagem até a aquisição de moléculas validadas, economizando semanas ou até meses de tempo de P&D.

Mais métodos de sequenciação NGS de fagos estão disponíveis como referência, "Sequenciação de Nova Geração para Análise de Fagos: Uma Abordagem Moderna".

A compreensão do papel dos dados de NGS no controlo de qualidade das bibliotecas de exibição de fagos pode ser referida em "Controlo de Qualidade para Bibliotecas de Exibição de Fagos com Dados de NGS".

Estudos de Caso: NGS em Ação

Estudo de Caso 1: Dominar o Viés de Amplificação

• Monitorização Dinâmica do Viés de Amplificação: A análise quantitativa de NGS revelou um substancial desvio na distribuição de clones após a amplificação, caracterizado por um aumento acentuado na representação do tipo selvagem (de 10,36% para 90,37% em SA1 e de 5,99% para 61,81% em SA2). Simultaneamente, foi observada uma redução drástica nos clones singulares (por exemplo, em SA2, de 96,66% para 24,6%), demonstrando que o processo de amplificação induz uma significativa homogeneização da biblioteca.
• Identificação de Motivos Funcionais: A análise utilizando o fator de enriquecimento (EF-RRB) identificou clones de alta eficiência, como as variantes Pr-TUP (por exemplo, em SA2, EF > 126.000). Esta abordagem permitiu o rastreamento de motivos associados à amplificação (por exemplo, May/Ramay, com pontuações de enriquecimento de até 142 vezes), enquanto excluía simultaneamente motivos relacionados a β-turn não funcionais, que não mostraram enriquecimento (todas as ES < 1) independentemente da eficiência de amplificação.
• Perfilamento Espaciotemporal de Aminoácidos: A análise revelou dinâmicas posicionais distintas, como um aumento de 3,7 vezes na frequência de arginina C-terminal após amplificação em SA1 e uma diminuição de 82% na leucina N-terminal dentro de SA2. Além disso, foram identificadas variações específicas de lote, incluindo a superexpressão de L-Fenilalanina em SA1 e um acentuado enriquecimento de tirosina em SA2.
• Orientações para a Otimização da Biblioteca: A distribuição de EF indicou que SA1 continha 3,2 vezes mais clones hiperproliferativos (EF > 10²) do que SA2, sublinhando a necessidade de limitar o número de ciclos de amplificação para prevenir viés. Além disso, foi aconselhado manter o teor de L-Cisteína abaixo de 1% para evitar potenciais interferências mediadas por ligações dissulfídicas (Sinkjaer A.W. et al., 2025)

Gráficos de barras empilhadas a visualizar a distribuição de frequência das sequências observadas nos dados de NGS dos experimentos SA1 e SA2 (Sinkjaer A.W. et al., 2025)

Estudo de Caso 2: Mineração do Kit de Ferramentas Oculto da Natureza

• Perfilagem Funcional de Comunidades de Alto Rendimento: Através do processamento de 691.206 leituras de NGS (compreendendo 153.002 sequências não redundantes), foi alcançada uma caracterização abrangente do metassecretoma microbiano do rúmen. Esta análise identificou 196 famílias de CAZyme, incluindo um enriquecimento de 14,3 vezes de celulases GH124, avançando substancialmente o estudo dos secretomas do rúmen além das limitações das metodologias convencionais. A validação subsequente do enriquecimento funcional confirmou a efetiva focalização de hidrolases extracelulares (por exemplo, esterases CE1/CE3). Notavelmente, as funções associadas ao transporte e metabolismo de carboidratos constituíram 19,4% do conjunto de dados, superando a linha de base metagenómica (10,6%) em 83%.
• Monitorização da Eficiência de Triagem: O processo demonstrou alta seletividade, resultando em um enriquecimento de 29 vezes de clones secretórios. A eficiência da apresentação de fusão PIII atingiu 94,4%, superando significativamente a expectativa teórica de 3,3%. Além disso, o sistema identificou e eliminou com sucesso 5,6% de clones não secretórios (por exemplo, peptídeos curtos e proteínas intracelulares), conservando assim recursos que teriam sido gastos na validação funcional destes.
• Otimização Direcionada de Bibliotecas: Os esforços de otimização concentraram-se na seleção de péptidos sinal, excluindo especificamente as vias do tipo II/TAT devido à sua incompatibilidade com o dobramento periplasmático em E. coli. Os péptidos sinal do tipo I foram, portanto, priorizados. A análise de compatibilidade do hospedeiro revelou uma predominância de sequências bacterianas Gram-negativas (por exemplo, 29% Bacteroidetes), atribuída à sua superior adaptação à maquinaria de processamento de péptidos sinal do hospedeiro (Ciric M et al., 2014).

Visão geral da construção e seleção da biblioteca de metasecretoma (Ciric M et al., 2014)

O Futuro: Design de Bibliotecas Inteligentes Potenciado por NGS

O NGS transcende a mera otimização de triagem, emergindo como um catalisador para uma arquitetura de biblioteca inovadora:

• Engenharia de Bibliotecas Informadas por Dados: A integração de conjuntos de dados históricos de NGS permite a construção de extensas bases de dados de sequências funcionais. Estes repositórios iluminam relações críticas entre sequência-estrutura-função, incluindo os efeitos de mutações combinatórias, regiões suscetíveis à plasticidade estrutural e motivos de ligação recorrentes. Modelos de aprendizagem automática, como redes neurais e modelos ocultos de Markov, podem ser treinados com estes dados para prever o impacto de mutações pontuais e combinatórias na afinidade e especificidade de ligação. Esta capacidade preditiva orienta a otimização de estratégias de mutagénese—informando a seleção de locais, tipos de mutação e frequências—e até facilita o design de proteínas de novo, exemplificado pelo desenvolvimento de andaimes de anticorpos humanizados estáveis. Consequentemente, esta abordagem eleva o design de bibliotecas de um processo empírico para uma estratégia racional e orientada por dados, melhorando significativamente a qualidade da biblioteca inicial e a eficiência subsequente da descoberta.
• Construção de Bibliotecas Sintéticas e Controlo de Qualidade: Com a diminuição do custo da síntese de DNA, as bibliotecas totalmente sintéticas (por exemplo, repertórios de anticorpos humanizados e bibliotecas de domínios de ligação personalizados) estão a ganhar destaque devido à sua flexibilidade de design e capacidade de contornar sequências imunogénicas. O NGS serve como o padrão definitivo de garantia de qualidade para estas bibliotecas, proporcionando verificação em larga escala da precisão da síntese de pools de oligonucleotídeos ao detetar erros (deleções, inserções, incompatibilidades). Além disso, quantifica a diversidade pós-amplificação para confirmar a conformidade com as especificações de design e identifica os enviesamentos introduzidos durante os fluxos de trabalho de síntese ou clonagem. Este rigoroso controlo de qualidade é fundamental, garantindo que as dispendiosas bibliotecas sintéticas cumpram os limiares pretendidos de qualidade e representatividade antes de comprometer recursos para triagens funcionais.

Estudo de Caso 1: Projetar Anticorpos Melhores desde a Base

Garantia de Qualidade de Bibliotecas Sintéticas

O NGS permite a validação em circuito fechado de bibliotecas sintéticas ao escanear milhões de clones. Este processo confirma a fidelidade do códon (por exemplo, verificando uma razão Ser/Tyr de 1:1 projetada na posição 117 do CDR3), garante a integridade do quadro de leitura através da deteção de mutações de deslocamento de quadro e contaminação por códon de paragem, e fornece uma quantificação precisa da diversidade—medindo com precisão 1,75×10⁸ clones únicos, um número que ultrapassa as estimativas tradicionais baseadas na eficiência de transformação.

Modelagem da Relação Estrutura-Atividade

A análise conformacional do NanoNet foi realizada em 10.000 sequências de nanobodies validadas por NGS. As simulações revelaram que os laços CDR3 de 14 aminoácidos adotam uma conformação dobrada exclusiva, demonstrando uma clara divergência estrutural da topologia estendida observada em laços mais curtos de 10 aminoácidos. Esta visão estrutural indica que o aumento do comprimento do CDR3 melhora a adequação molecular para interagir com superfícies de ligação côncavas.

Estratégias de Otimização de Estabilidade

Para melhorar a estabilidade, os dados de NGS orientaram a eliminação de clusters hidrofóbicos expostos à superfície para mitigar a propensão à agregação. Além disso, foi utilizada engenharia polar para introduzir estrategicamente resíduos hidrofílicos (por exemplo, alcançando >80% de conteúdo de aminoácidos polares em locais específicos como CDR1-Asn31), melhorando assim a solubilidade e a integridade estrutural da proteína.

Avanços Revolucionários

Esta pesquisa transformou o design de bibliotecas, passando de abordagens empíricas para uma estratégia racional orientada por estruturas, informada por mais de 600 estruturas de nanobodies do PDB. Um avanço chave é a superação das limitações imunológicas naturais, uma vez que bibliotecas sintéticas permitem comprimentos de CDR3 superiores a 24 aminoácidos. As estruturas estabilizadas resultantes possibilitam o direcionamento de interações proteína-proteína intracelulares anteriormente consideradas inacessíveis, enquanto a arquitetura modelada permite uma iteração rápida de variantes de comprimento de CDR, abrindo novas avenidas para o desenvolvimento terapêutico (Moreno E et al., 2022).

Frequências de aminoácidos por posição aleatorizada para a biblioteca construída (Moreno E et al., 2022)

Desafios e Direções Futuras

Apesar da transformação impulsionada pelo NGS, limitações chave persistem:

Restrições Técnicas

• Viés de Amplificação:
  • A PCR durante a preparação da biblioteca distorce a representação da frequência de sequências. As estratégias de mitigação incluem:
    • Polimerases de alta fidelidade;
    • Números de ciclos otimizados;
    • Códigos de barras moleculares.
• Limitações de Comprimento de Leitura: Plataformas de leitura curta (por exemplo, Illumina) requerem montagem de leituras para grandes inserções (por exemplo, fragmentos scFv), podendo comprometer a precisão em regiões variáveis complexas. Embora as tecnologias de leitura longa (PacBio, Oxford Nanopore) ofereçam soluções, equilibrar custo, rendimento e precisão continua a ser um desafio.

Demandas Computacionais

• Complexidade do Processamento de Dados:
  • Gerir grandes conjuntos de dados de NGS requer pipelines bioinformáticos sofisticados para:
    • Controlo de qualidade e deduplicação;
    • Montagem/anotação de sequências;
    • Alinhamento, análise de frequência e enriquecimento diferencial;
    • Descoberta de motivos

Isto cria requisitos significativos de recursos computacionais e de especialização.

Considerações Económicas

• Equilíbrio Custo-Benefício: Apesar da diminuição dos custos de sequenciação, a sequenciação profunda de grandes bibliotecas—particularmente em várias rondas de triagem—implica despesas substanciais. A alocação estratégica de recursos deve alinhar-se com o alcance do projeto e as limitações orçamentais.

Conclusão: O Microscópio Indispensável

A NGS transformou fundamentalmente a tecnologia de exibição de fagos, proporcionando uma perspetiva molecular sem precedentes, controlo de processos e eficiência de triagem. Ao instalar um "microscópio molecular de alta resolução" em todo o processo de construção de bibliotecas e biopanning, a NGS converte processos tradicionalmente opacos em sistemas quantitativamente analisáveis e dinamicamente otimizáveis.

• Os principais avanços que foram possibilitados incluem:
  • Caracterização abrangente da biblioteca;
  • Monitorização de panorâmica em tempo real;
  • Identificação precisa de clones de alto valor;
  • Design de biblioteca inteligente baseado em dados;
  • Controlo de qualidade rigoroso de bibliotecas sintéticas.

Estas capacidades aceleram a descoberta de moléculas alvo (anticorpos, ligandos) enquanto elevam as taxas de sucesso. Para além da otimização, o NGS expande a fronteira de inovação da tecnologia—demonstrado através da nossa implementação de biblioteca híbrida custo-efetiva.

Trajetória Futura

• A sinergia da exibição de fagos NGS continuará a impulsionar avanços em:
  • Desenvolvimento de anticorpos terapêuticos;
  • Engenharia de proteínas de precisão;
  • Design avançado de biossensores;
  • Estudos fundamentais de interacções moleculares.

Na exploração de paisagens funcionais de proteínas, o NGS surge como uma ferramenta indispensável—capacitando os cientistas a recuperar gemas funcionais de oceanos moleculares com uma precisão e eficiência sem igual.

Para uma abordagem mais detalhada ao sequenciamento de fagos, consulte "Sequenciação do Genoma de Fagos: Métodos, Desafios e Aplicações.

Para mais informações sobre sequenciação do fago M13, consulte "Sequenciação do Genoma do Fago M13: Desde Bibliotecas de Exibição até Análise de Dados.

As Pessoas Também Perguntam

Quais são os benefícios da exibição de fagos?

Uma das suas principais forças é a triagem de alto rendimento, permitindo que os investigadores identifiquem rapidamente ligadores de antígenos-alvo em um único experimento.

Como funcionam as bibliotecas de exibição de fago?

A biblioteca de exibição de fágios é incubada com a molécula-alvo imobilizada em um suporte sólido. O fágios específicos da biblioteca ligam-se à molécula e os fágios não ligados são lavados. Os fágios específicos são eluídos e amplificados em bactérias.

O que é a exibição de fagos e por que foi útil para a evolução dirigida?

Evolução dirigida por exibição de fago | LIPhy - Universidade ...

A exibição de fagos é uma técnica de evolução dirigida utilizada para selecionar e otimizar proteínas (fragmentos de anticorpos) ou peptídeos com propriedades desejadas.

Qual é o princípio da exibição de fagos?

Exibição de fagos - Wikipédia

Nesta técnica, um gene que codifica uma proteína de interesse é inserido num gene de proteína da cápside de um fago, fazendo com que o fago "exiba" a proteína na sua parte externa enquanto contém o gene para a proteína no seu interior, resultando numa ligação entre genótipo e fenótipo.

Qual é a diferença entre a exibição de fagos e a exibição de ribossomas?

Exibição de Fagos – utiliza bacteriófagos para apresentar peptídeos/proteínas na sua superfície. Exibição de Ribossomas – sistema livre de células que mantém um complexo de mRNA, ribossoma e proteína nascente.

Referências:

1. Noh J, Kim O, Jung Y, Han H, Kim JE, Kim S, Lee S, Park J, Jung RH, Kim SI, Park J, Han J, Lee H, Yoo DK, Lee AC, Kwon E, Ryu T, Chung J, Kwon S. Recuperação de DNA físico em grande escala para clones identificáveis por NGS em biblioteca de fago-display. MAbsAbr 2019;11(3):532-545.
2. Sinkjaer AW, Sloth AB, Andersen AO, Jensen M, Bakhshinejad B, Kjaer A. Uma análise comparativa da composição de sequências em diferentes lotes de uma biblioteca de peptídeos de phage display durante a amplificação.. Virol J1 de fevereiro de 2025; 22(1):24.
3. Ciric M, Moon CD, Leahy SC, Creevey CJ, Altermann E, Attwood GT, Rakonjac J, Gagic D. Abordagem de exibição de fago seletiva para metassecretoma para explorar o potencial funcional de uma comunidade microbiana do rúmen. BMC Genómica. 12 de maio de 2014; 15(1):356.
4. Moreno E, Valdés-Tresanco MS, Molina-Zapata A, Sánchez-Ramos O. Design e construção de uma biblioteca de nanobodies sintéticos baseada em estrutura com exibição de fago. BMC Notas de Pesquisa. 2022 Mar 29;15(1):124.
5. Pashova S, Schneider C, von Gunten S, Pashov A. Perfilagem do repertório de anticorpos com arrays de mimotopos. Hum Vacina Imunoterapia. Fevereiro de 2017;13(2):314-322.
6. Vekris A, Pilalis E, Chatziioannou A, Petry KG. Um Pipeline Computacional para a Extração de Informação Biológica Acionável a Partir de Experimentos de Exibição de Fagos NGS. Front Physiol2019, 24 de setembro; 10:1160.