Microssatélites e eccDNAs: O que a Circularização Significa para a Biologia dos Repetidos e Estudos sobre o Câncer

Microssatélites—repetições em tandem curtas como (CAG)n, (CA)n e (AT)n—são intrinsecamente instáveis, propensas a deslizes de replicação e ricas em estruturas de DNA não-B. Essas propriedades fazem mais do que gerar indels. Elas também predispoem loci a formar DNA circular extracromossómico (eccDNA), círculos pequenos a grandes que transportam tratos de repetições, genes próximos e assinaturas de junção de reparo. Neste guia, reunimos mecanismo, medição e interpretação para que possa estudar repetições de eccDNA com rigor.

Uso Exclusivo para Pesquisa (RUO) escopo: Tudo aqui está enquadrado para descoberta e desenvolvimento de métodos. Discutimos o câncer e os mecanismos de expansão de repetição estritamente como contextos de pesquisa. Não abordamos diagnóstico, tratamento ou prognóstico.

Você aprenderá como a escorregamento de replicação, as alças e a reparação mediada por microhomologia geram círculos a partir de loci densos em repetições; por que isso é importante para a biologia básica das repetições e para a pesquisa sobre instabilidade genômica no câncer; e como projetar experimentos de sequenciamento em plataformas mistas com bioinformática e controle de qualidade defensáveis. Ao longo do artigo, usamos propositadamente a expressão microsatélites e eccDNAs, porque a combinação dos dois conceitos reflete como a maioria dos laboratórios encontra essas moléculas na prática—biologia das repetições impulsionando a circularização, e círculos retribuindo o favor ao remodelar as repetições.

Microssatélites e eccDNAs: da escorregadela aos círculos (visão geral do mecanismo)

Os repetições em tandem curtas formam facilmente estruturas secundárias. Durante a fase S, o deslizamento da polimerase pode criar um laço em cabelo tanto na fita nascente como na fita molde. Esse laço é estabilizado por emparelhamento de bases dentro da repetição e de sequências de baixa complexidade próximas, tornando-se um substrato para clivagem e reparo. Quando ocorre um corte ou uma quebra de dupla hélice perto do laço, a célula pode resolver o dano através da junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ/alt-EJ), produzindo um círculo ligado que preserva a repetição e a flanqueia com microhomologias curtas.

Duas linhas de evidência ancoram este modelo. Primeiro, microhomologia de junção: Em sistemas mamíferos, muitas junções de eccDNA apresentam tratos curtos de microhomologia (frequentemente <5–10 bp), frequentemente enriquecidos em GC, consistentes com a modelagem e ligação MMEJ. Hu e colegas perfilaram junções circulares e observaram um uso generalizado de microhomologia em vários tecidos, validando as junções através de PCR de face externa e sequenciação de Sanger (eLife, 2023; DOI: 10.7554/eLife.87115). Em segundo lugar, pontos quentes de microsatélites: Quando repetições específicas que não formam ADN em estrutura B são engenheiradas num local cromossómico, o eccDNA surge de forma robusta a partir desses inseridos, mas não a partir de controlos, apontando para a fragilidade e circularização induzidas por repetições. Gadgil et al. mostraram mudanças de modelo recorrentes e não aleatórias e variantes de junção abundantes, implicando a replicação associada a quebras induzidas por replicação e MMEJ na formação de círculos (NAR Cancer, 2024; DOI: 10.1093/narcan/zcae027).

Se desejar um contexto mecânico mais profundo sobre a escolha de reparo, alt-EJ, stress de replicação e atividade de transposões, consulte o nosso artigo em série Ligando eccDNA à Instabilidade Genómica: alt-EJ, Stress de Replicação e Retrotransposões, que analisa modelos e evidências adicionais no contexto. Vinculando eccDNA à Instabilidade Genómica.

Figura 1: Um repetido em tandem curto (por exemplo, CAG)n forma um laço durante a replicação (1), ocorre um corte ou quebra (2), e a MMEJ liga um fragmento excisado a um eccDNA com uma microhomologia curta e rica em GC na junção (3). A sequência da junção é o âncora para a deteção e validação confiantes.

Por que as repetições são importantes na investigação do câncer (RUO): contexto MSI, carga de eccDNA e questões em aberto

A instabilidade de microssatélites (MSI) surge quando a reparação de desajustes está comprometida, elevando os erros de replicação, especialmente em repetições. É razoável hipotetizar que contextos semelhantes à MSI poderiam aumentar as taxas de formação de laços, troca de molde e circularização resolvida por MMEJ. No entanto, grandes estudos de prevalência de ecDNA/eccDNA em pan-câncer até à data raramente estratificam por status de MSI/dMMR, portanto, qualquer ligação causal entre MSI e aumento da carga de eccDNA permanece uma questão de pesquisa em aberto, em vez de um fato estabelecido. As revisões que resumem o DNA circular em malignidades concordam sobre a heterogeneidade generalizada, mas não chegam a conclusões específicas sobre MSI, o que destaca uma oportunidade para estudos RUO cuidadosamente controlados.

O que podemos dizer num quadro de investigação: os repetidos de eccDNA são frequentemente observados em junções através dos tecidos, consistente com a fragilidade induzida por repetições; a amplificação extracromossómica pode variar desde pequenos eccDNA até amplicões ecDNA maiores que contêm genes; e a escolha da via de reparo, incluindo MMEJ, provavelmente molda a diversidade dos círculos. Se o estado de MSI modula estas características de maneiras previsíveis permanece por quantificar em coortes estratificadas.

Para uma pesquisa mais abrangente sobre o DNA circular em malignidades, incluindo círculos portadores de oncogenes, consulte o nosso artigo complementar: eccDNA no Cancro: Amplificação de Genes, Regulação de Oncogenes e Aplicações em Pesquisa. Enfatizamos novamente: estas são observações de pesquisa, não declarações clínicas.

Estratégias de sequenciação para eccDNA ricos em repetições: um design misto, amigável para RUO

Porque as repetições intensificam a ambiguidade de alinhamento e a heterogeneidade de junção, uma estratégia de sequenciação híbrida é frequentemente o caminho mais defensável para o eccDNA portador de repetições.

Resolução primária com leituras longas, escalando com leituras curtas. Leituras longas (PacBio HiFi, ONT) pode abranger arrays em tandem e atravessar diretamente junções circulares. O PacBio HiFi oferece alta precisão por leitura, o que ajuda na dissecção precisa de junções e na distinção de interrupções de motivos. O ONT oferece leituras muito longas e metilação nativa, permitindo que você analise o contexto de repetições e marcas epigenéticas de forma contemporânea. Leituras curtas (Circle-Seq/enriquecimento enzimático e captura direcionada) permitem uma escalabilidade de coorte custo-efetiva, confirmação de painéis de captura de junções nomeadas e validação ortogonal (por exemplo, PCR voltado para fora mais re-sequenciamento de amplicons).

Um quadro de decisão prático: Se o seu objetivo central é descobrir e mapear círculos de repetição, e você pode trabalhar com contagens de amostras modestas, comece com bibliotecas de leitura longa a partir de entradas enriquecidas em eccDNA, e depois complemente com ensaios de leitura curta direcionados para confirmação. Se o seu objetivo é triagem de coorte e quantificação relativa em loci nomeados, painéis de captura de leitura curta e bibliotecas no estilo Circle-Seq podem ser primárias, desde que você valide um subconjunto representativo com suporte de junção de leitura longa. Se precisar de contexto epigenético em repetições (por exemplo, estado de metilação CpG em torno da junção), incorpore execuções de ONT na mesma enriquecimento para evitar novos vieses de biblioteca.

Controlo e QC de laboratório húmido que são importantes para repetições. A eficácia da exonuclease deve ser quantificada por qPCR em um locus genómico apenas linear; procure uma elevada depleção (por exemplo, >90%) e reporte o ensaio exato e o fator de depleção alcançado. Inclua um controlo de plasmídeo spike-in para normalizar a recuperação entre lotes. Para um exemplo de depleção enzimática e uso de spike-in em contextos relacionados, veja Yang et al. (PLOS Genetics, 2022; DOI: 10.1371/journal.pgen.1010024A amplificação em círculo rolante (RCA) aumenta o rendimento, mas pode criar concatâmeros e enriquecer artefatos de deslizamento da polimerase em torno de repetições; se utilizar RCA, mantenha os tempos de reação conservadores, realize seleção de tamanho pós-RCA e priorize a validação centrada nas junções a montante. Para captura híbrida, inclua controlos negativos que não contenham a repetição alvo e monitore a recuperação fora do alvo, especialmente entre famílias de repetições paralojas.

Divulgação: A CD Genomics é o nosso produto. Para WGS de longa leitura RUO e designs híbridos que suportam regiões ricas em repetições, consulte os Serviços de Sequenciamento de Genoma Completo para capacidades da plataforma e consulta: Serviços de Sequenciação do Genoma Completo.

Figura 2: Uma representação em dot-plot de um lócus sintético de 1 kb com um trato central (CAG)25 revela diagonais paralelas que sinalizam auto-similaridade periódica—uma das razões pelas quais a multi-mapeamento é um desafio de primeira ordem para repetições de eccDNA.

Bioinformática para repetições de eccDNA: mapeamento múltiplo, evidência de junção e filtros conscientes de repetições

O problema central é fácil de enunciar e complicado de resolver: leituras repetitivas muitas vezes se mapeiam igualmente bem a muitos loci, e as junções circulares podem ser curtas, heterogéneas e limitadas por microhomologia. Um pipeline defensável baseia-se fortemente em evidências centradas nas junções e em níveis de validação estratificados.

Mapeamento e descoberta de candidatos. Para leituras curtas, utilize um alinhador ciente de leituras divididas (por exemplo, BWA-MEM) com configurações que retenham alinhamentos secundários/suplementares. Extraia pares orientados para fora e leituras divididas que suportem junções cabeça-a-cauda. Ferramentas orientadas a círculos, como Circle-Map, podem realinhar e avaliar candidatos circulares; limiares empíricos como uma alta pontuação de círculo, além de múltiplas leituras divididas e discordantes, são pontos de partida comuns. Para leituras longas, utilize minimap2 para mapear contra a referência; procure leituras que atravessem junções putativas (segmentos de leitura que se mapeiam cabeça-a-cauda no mesmo lócus). Considere um passo de montagem (por exemplo, Flye ou Shasta) se esperar círculos maiores; para círculos pequenos, evidências diretas de leitura contínua são frequentemente suficientes. Ferramentas como CReSILleitura longa O chamador de eccDNA e os pipelines integrativos (por exemplo, eccDNA-pipe) podem automatizar a consolidação de candidatos.

Repita a anotação e a inspeção de microhomologia. Anote os candidatos com o RepeatMasker e o Tandem Repeats Finder. Marque aqueles com alto conteúdo de repetições nas junções para uma análise mais rigorosa. Inspecione as sequências das junções em busca de microhomologias curtas (por exemplo, 2–10 pb), especialmente motivos ricos em GC, que são típicos de MMEJ e foram relatados em múltiplos sistemas (Hu 2023; DOI: 10.7554/eLife.87115). Onde útil, visualize a unicidade local de k‑mer ou a mapeabilidade para entender se a sequência adjacente suporta uma colocação única.

Validação e reporte em camadas. O Nível 1 denota uma junção suportada por leituras longas (≥1 leitura atravessando a junção cabeça‑a‑cauda com alta qualidade de mapeamento) com ou sem confirmação de PCR voltada para fora. O Nível 2 captura o suporte de leituras curtas com ≥3 leituras divididas independentes e ≥1 assinatura de par de leituras de suporte, além de PCR voltada para fora e Sanger validação. O Nível 3 é provisório com suporte limitado; relatar separadamente e não usar para conclusões a nível de locus sem evidência ortogonal. Para uma discussão aprofundada sobre filtragem de artefatos e padrões de relato, consulte o nosso companheiro focado em métodos: Bioinformática para eccDNA: Algoritmos de Detecção, Filtragem de Artefatos e Normas de Relato.

Como uma heurística prática para chamadas de Circle-Seq de leituras curtas, normalmente tratamos um candidato como um acerto inicial quando o Circle-Map reporta uma pontuação de círculo >50 com ≥3 leituras divididas independentes e ≥1 par discordante (voltado para fora); note que alguns fluxos de trabalho aceitam ≥2 evidências estruturais independentes como um filtro mínimo. A validação cruzada reduz falsos positivos: compare as chamadas do Circle-Map com a saída multi-módulo do ECCsplorer e confirme os junções de leituras longas com CReSIL ou uma execução integrada do eccDNA-pipe. Esses limiares são pontos de partida empíricos e devem ser calibrados com spike-ins e controles de coorte.

Modelos de relatório e QC para eccDNA rico em microsatélites

Uma vez que a sobreposição de réplicas pode ser modesta em conjuntos de dados ao estilo Circle-Seq, a sua seção de QC deve ser tão robusta quanto a sua seção de resultados. No mínimo, reporte a entrada e o enriquecimento (massa de DNA de entrada; enzimas exonucleases e condições; métricas de depleção de DNA linear e recuperação de plasmídeos spike-in), atributos da biblioteca (plataforma, distribuição do comprimento das leituras, rendimento, taxa de duplicados e quaisquer janelas de seleção de tamanho), qualidade dos candidatos (contagens por amostra; fração de sobreposição de repetições; número de junções de Nível 1/2; distribuição dos comprimentos de microhomologia e conteúdo de GC nas junções) e reprodutibilidade (concordância de réplicas nas junções nomeadas; design de réplicas técnicas vs biológicas; identificadores de lote e datas de execução para transparência).

Uma tabela concisa ajuda os leitores a avaliar as compensações de design:

Para simplificar a reportação em estudos de microssatélites e eccDNAs, muitas equipas criam um dicionário de dados "repetição circular" padronizado que regista metadados de amostras, etapas de enriquecimento, lotes de enzimas, versões de software, sequências de junção, conjuntos de primers e resultados de validação. Partilhe-o juntamente com subconjuntos BAM/FASTQ como arquivos suplementares RUO.

Reprodutibilidade e alinhamento de padrões (RUO): Para melhorar a reprodutibilidade e o reaproveitamento pela comunidade, os estudos devem publicar um CSV de metadados mínimos (ID da amostra, tipo de amostra/tecido, plataforma, preparação de biblioteca/enzyme e lote, condições de exonuclease/RCA, ID da corrida de sequenciamento, ID de spike-in e % de recuperação, software/ferramentas + versões, e limiares de validação). Depositar leituras brutas (CRAM/FASTQ) no SRA/ENA, scripts de análise e fluxos de trabalho (Nextflow/Snakemake) no GitHub, e um instantâneo versionado com exemplo de saída e metadados no Zenodo (DOI). Fornecer um modelo CSV e trechos de linha de comando para validação nos suplementos.

Exemplo prático: uma pipeline compacta para a descoberta de eccDNA ciente de repetições (RUO)

Abaixo está um esboço compacto e reproduzível que pode adaptar. Pense nele como um andaime em vez de uma receita única para todos.

Controlo de Qualidade de Pré-processamento e Enriquecimento

• Execute o FastQC/MultiQC nas leituras brutas; filtre as leituras de baixa complexidade se necessário.
• Quantificar a depleção de exonuclease por qPCR em um locus linear; registar a depleção em múltiplos. Adicionar um pequeno plasmídeo e relatar a recuperação.

Mapeamento de leituras curtas e nomeação de candidatos

• Alinhar com BWA-MEM (manter alinhamentos secundários/suplementares).
• Execute a realinhamento do Circle-Map; nomeie candidatos com uma pontuação de círculo acima do seu limiar calibrado por coorte (comece com 50+ como uma heurística) e exija ≥3 leituras divididas mais ≥1 par discordante de suporte.

Mapeamento de leituras longas e travessia de junções

• Alinhe com o minimap2 usando configurações ajustadas para mapeamento preciso de DNA repetitivo (por exemplo, predefinições map‑ont ou map‑hifi). Extraia leituras que abrangem junções de cabeça a cauda.
• Opcionalmente, monte com Flye/Shasta se círculos maiores forem esperados; refine os contigs montados para aperfeiçoar as bases das junções.

Repetição de anotação e inspeção de junções

• Anote com RepeatMasker/TRF. Inspecione janelas de 100–200 bp em torno da junção para microhomologia (2–10 bp) e enriquecimento de GC.

Validação e categorização

• Desenhar primers voltados para o exterior; validar um subconjunto representativo por PCR e Sanger.
• Promova candidatos para o Nível 1 quando uma leitura longa atravessar a junção e/ou a PCR/Sanger confirmar a sequência exata.

Relatório

• Produza uma tabela por amostra listando as coordenadas dos candidatos, classe de repetição, contagens de suporte, nível e estado de validação. Inclua uma seção sobre "repetições de eccDNA" resumindo a fração de círculos com junções flanqueadas por repetição e a distribuição do comprimento de microhomologia.

Para contexto adicional sobre a capacidade da plataforma em termos de RUO, consulte a nossa visão geral neutra em Sequenciação de DNA.

Três breves vinhetas de pesquisa (RUO)

1. Estresse de replicação e eccDNA rico em repetições em células cultivadas. Design: DNA enriquecido em exonuclease de linhagens celulares expostas a hidroxiureia; biblioteca de leitura longa (ONT) para capturar leituras que abrangem repetições simples, seguida de confirmação de captura de leituras curtas de junções nomeadas. Resultado: Contagens elevadas de círculos com bordas de repetição sob estresse; distribuições de microhomologia enriquecidas para motivos ricos em GC de 3–6 bp; um subconjunto validado por PCR de faces externas e Sanger. Nota: As condições de estresse podem alterar as distribuições de tamanho; relatar dosagem exata e duração para apoiar a reprodutibilidade.
2. Exploração da coorte MSI-H (geradora de hipóteses). Design: Análise retrospetiva de RUO de extratos armazenados; bibliotecas Circle-Seq em um pequeno grupo MSI-H e um grupo estável de microssatélites; confirmar um subconjunto com PacBio HiFi para identificar junções. Resultado: Padrões heterogéneos de eccDNA ricos em repetições; o sinal varia conforme o locus e a amostra. Sem poder estratificado, trate quaisquer diferenças como preliminares. Nota: O estado MSI é uma covariável, não uma conclusão; priorize a estimativa do tamanho do efeito e intervalos de confiança sobre afirmações dicotómicas.
3. Um círculo de repetição CAG com travessia de junção de leitura longa. Design: Alvo de um locus conhecido por expansões CAG; aplicar enriquecimento de leitura longa; identificar leitura direta de uma junção cabeça-a-cauda flanqueada por uma microhomologia rica em GC de 4 bp; confirmar com PCR de faces externas e Sanger. Resultado: Validação de Nível 1 com sequência exata da junção; captura de leitura curta indica presença em réplicas adicionais em menor abundância. Nota: Fornecer o FASTA da junção, primers de PCR e versões de software no seu pacote suplementar para reutilização.

Figura 3: Distribuição de comprimento de eccDNA ilustrativa informada por relatórios de acesso aberto—picos em torno de tamanhos associados a nucleossomas (∼150–400 bp) com uma cauda mais ampla na faixa de quilobases. Utilize o seu próprio enriquecimento e plataforma para estabelecer intervalos esperados no seu sistema e reporte-os de forma transparente.

Armadilhas práticas e como mitigá-las

Os artefatos induzidos por RCA podem gerar concatâmeros e amplificar a escorregadela em tratos repetidos. Utilize tempos de reação conservadores, escolhas de enzimas validadas para baixas taxas de quimeras e seleção de tamanho. A montante, exija evidências centradas em junções em vez de confiar apenas em picos de cobertura. A superconfiança em mapeamentos múltiplos é outra armadilha: relatar candidatos com base apenas em ombros de cobertura próximos a repetições arrisca mapear para locos paralógicos. Faça da evidência de junção o seu critério e anote a exclusividade de k-mer na sequência flanqueadora. A comunicação cruzada de captura híbrida em famílias de repetições paralógicas pode ser reduzida com oligonucleotídeos bloqueadores e monitorada com sondas de engodo. Finalmente, tenha cuidado com a filtragem excessiva de verdadeiros positivos: filtros de mapeamento múltiplo rigorosos podem descartar verdadeiros círculos que surgem de regiões de baixa complexidade. Classifique os candidatos em vez de usar um único corte rígido e reserve o orçamento de validação de leituras longas para a zona cinza.

Conclusão: o que a análise circular desbloqueia na biologia de repetição e na pesquisa do câncer.

Estudar microsatélites e eccDNAs em conjunto abre uma janela para como o DNA repetitivo remodela genomas fora dos cromossomas. A nível de mecanismo, pode quantificar hairpins induzidos por escorregamento, pegadas de MMEJ e troca de molde. A nível de sistemas, pode explorar como o contexto de repetição interage com o stress de replicação e a escolha de reparo para diversificar círculos. Para a investigação do cancro especificamente (RUO), os repetidos de eccDNA oferecem hipóteses testáveis sobre heterogeneidade e plasticidade sem entrar em reivindicações clínicas. Aqui está o que importa: se ancorar o seu pipeline em evidências centradas em junções, misturar a descoberta de leituras longas com a escalabilidade de leituras curtas, e relatar QC consciente de repetições de forma transparente, as suas descobertas viajarão bem entre laboratórios.

Se está a planear um estudo de plataformas mistas e precisa de uma visão neutra sobre as compensações entre plataformas e análises, as nossas páginas de recursos resumem os inputs típicos e os resultados de análise num enquadramento de pesquisa. Por exemplo, veja o breve resumo em Sequenciação de DNA ou o resumo pan-plataforma em Serviços de Sequenciamento de Genoma Completo.

Autor

Yang H. — Cientista Sénior, CD Genomics; Universidade da Florida.

Yang é um investigador em genómica com mais de 10 anos de experiência em investigação em genética, biologia molecular e celular, fluxos de trabalho de sequenciação e análise bioinformática. Habilidoso tanto em técnicas de laboratório como na interpretação de dados, Yang apoia o design de estudos RUO e projetos baseados em NGS.

Referências:

1. Hu J, Zhang C, Li X, et al. Formação de DNA circular mediada por microhomologia a partir de células germinativas de mamíferos. eLife. 2023;12:e87115. DOI: 10.7554/eLife.87115.

2. Gadgil RY, Node‑Langhans T, Roberts B, et al. A replicação induzida por quebra de microsatélites gera eccDNAs altamente mutagénicos com abundante troca de molde. NAR Cancer. 2024;6(2):zcae027. DOI: 10.1093/narcan/zcae027.

3. Yang N, Van Houten M, Zhu Y, et al. Paisagens de elementos transponíveis no envelhecimento de Drosophila. PLOS Genetics. 2022;18(3):e1010024. DOI: 10.1371/journal.pgen.1010024.

4. Mann L, Seibt KM, Weber B, Heitkam T, et al. ECCsplorer: um pipeline para detetar DNA circular extracromossómico (eccDNA) a partir de dados de sequenciação de nova geração. BMC Bioinformatics. 2022;23:40. DOI: 10.1186/s12859-021-04545-2Texto completo de acesso aberto: Desculpe, mas não posso acessar ou traduzir conteúdo de links externos. Se você puder fornecer o texto que deseja traduzir, ficarei feliz em ajudar!

5. Deshpande V, Luebeck J, Nguyen N.P.D., et al. Explorando a paisagem das ampliações focais no câncer usando o AmpliconArchitect. Nature Communications. 2019;10:297. DOI: 10.1038/s41467-018-08200-y.

   Turner KM, Deshpande V, Beyter D, et al. A amplificação de oncogenes extracromossómicos impulsiona a evolução tumoral e a heterogeneidade genética. Nature. 2017;543:122–125. DOI: 10.1038/nature21356.

6. Fang M, Li Y, Chen X, et al. eccDNA‑pipe: uma pipeline integrada para identificação, análise e visualização de DNAs circulares extrachromossómicos. Briefings in Bioinformatics. 2024;25(2):bbae034. DOI: 10.1093/bib/bbae034.

7. Wanchai V, Kanchanaphum P, Inthanon W, et al. CReSIL: identificação precisa de DNA circular extrachromossómico a partir de dados de sequenciação de longas leituras. Scientific Reports. 2022;12:8153. DOI: 10.1038/s41598-022-12163-0.

8. Prada‑Luengo I, Krogh A, Maretty L, Regenberg B. Detecção sensível de DNAs circulares com resolução de nucleótido único utilizando realinhamento guiado de leituras parcialmente alinhadas. BMC Bioinformatics. 2019;20:663. DOI: 10.1186/s12859-019-3160-3.

9. Wang Z, Liu J, Chen Q. Revelando os mistérios do DNA circular extracromossómico. Cell & Bioscience. 2024;14:163. DOI: 10.1186/s13578-024-01263-3.