Visão Geral da Sequenciação por Captura de Metilação de DNA

Metilação de DNA e locais CpG

A metilação de DNA destaca-se como uma área proeminente de investigação no âmbito da epigenética. Este fenómeno envolve a conversão de citosina na extremidade 5' de dinucleotídeos dentro de ilhas CpG de sequências de DNA genómico em 5' metilcitosina (5mC), facilitada pela atividade enzimática da metiltransferase de DNA (DNMT). Esta modificação não induz alterações nas sequências genéticas; no entanto, exerce uma influência regulatória na expressão genética, moldando assim funções biológicas.

As características distintivas da metilação de DNA envolvem a metilação seletiva de citosina, um processo que é reversível por natureza. Nos genomas mamíferos, a metilação de DNA é notavelmente prevalente em locais CpG, onde os resíduos de citosina são alvo. Estes locais CpG exibem uma natureza dual: estão dispersos ao longo da sequência genómica, com aproximadamente 70-80% a sofrer metilação, e também podem coalescer para formar regiões altamente concentradas conhecidas como ilhas CpG. Esta intrincada interação das dinâmicas de metilação em locais CpG dispersos e agregados desempenha um papel crucial na regulação da expressão genética, influenciando várias funções biológicas sem alterar o código genético subjacente.

Sequenciamento de Captura de Metilação de DNA

Avançando o campo do sequenciamento de metilação de DNA, os cientistas integraram de forma harmoniosa a tecnologia de sequenciamento de nova geração. Esta abordagem inovadora representa um salto significativo em relação à plataforma de sequenciamento Sanger, oferecendo aos clientes uma solução personalizada marcada por um aumento na capacidade de processamento e eficiência. Aproveitando a conversão de bisulfito e a plataforma NGS, a nossa tecnologia proprietária de sequenciamento por captura de amplicon e sonda facilita a deteção de locais de metilação específicos após a captura. Este método de sequenciamento direcionado, fundamentado na conversão de bisulfito, demonstra versatilidade em amostras biológicas de diversas espécies. Além disso, o serviço de sequenciamento baseado em NGS garante resolução de base única, permitindo a identificação precisa da C-metilação em cada molécula de DNA. Este nível de resolução capacita uma análise precisa de mutações e quantificação digital da percentagem de moléculas de DNA metiladas, destacando uma vantagem distinta na obtenção de alta precisão de deteção.

Tipos de Sequenciamento de Captura de Metilação de DNA

• Estratégia de PCR Multiplex

O programa emprega uma estratégia de PCR multiplex utilizando primers bis-específicos metilados. As bibliotecas amplificadas direcionadas passam por sequenciamento através de um processo específico de PCR multiplex com primers metilados. Esta abordagem utiliza múltiplos pares de primers específicos de sequência convertidos em bisulfito para amplificar a região alvo do DNA, seguida de sequenciamento de nova geração (NGS).

Vantagens: Este método permite uma análise rápida e precisa do estado de metilação em várias ou dezenas de regiões alvo, alcançando resolução de base única. O cálculo preciso da proporção de moléculas de DNA metiladas acrescenta às forças do programa.

• Estratégia de Semi-Biblioteca

Esta abordagem inovadora permite o sequenciamento direcionado de regiões metiladas através de múltiplas extensões de primers específicos. Aproveitando uma semi-biblioteca e tecnologia de enriquecimento por extensão de primers específicos, os utilizadores ganham a capacidade de sequenciar regiões específicas, melhorando significativamente a profundidade de sequenciamento e o rendimento da amostra, enquanto minimizam custos.

Vantagens: O método possui alta capacidade de processamento, permitindo uma análise rápida e precisa do estado de metilação em dezenas e centenas de regiões alvo. Os utilizadores também podem alcançar cálculos precisos da proporção de moléculas de DNA metiladas, solidificando ainda mais as vantagens da tecnologia.

• Sequenciamento de Captura por Hibridização Baseada em Sonda

O sequenciamento de bibliotecas direcionadas é realizado através da captura por hibridização de sequências alvo específicas utilizando um conjunto de sondas projetadas para sequências de bisulfito metiladas. Este método envolve a pré-amplificação de sequências transformadas em bisulfito, seguida da captura do template de DNA alvo através da hibridização com uma sonda de biotina. Subsequentemente, as sequências marcadas com biotina são imobilizadas em esferas magnéticas e sujeitas a sequenciamento via sequenciamento de nova geração (NGS).

Vantagens: Esta abordagem oferece maior capacidade de processamento, facilitando a análise rápida do estado de metilação em centenas ou milhares de regiões alvo com resolução de base única. O método destaca-se no cálculo preciso do conteúdo de moléculas de DNA metiladas, sublinhando a sua eficiência e precisão.