Como Isolar o DNA Mitocondrial: Um Guia Abrangente

As mitocôndrias, encontradas em quase todas as células, são organelas semelhantes a pequenas centrais elétricas que geram a energia necessária para manter as funções básicas da célula. A informação genética das mitocôndrias é armazenada em DNA mitocondrial O ADNmt, que se encontra maioritariamente na forma de moléculas circulares, mas também inclui moléculas lineares. Ao contrário do ADN nuclear, o ADNmt é uma molécula de ADN de dupla hélice desnuda que não está protegida por histonas e está localizada perto de espécies reativas de oxigénio. Estes fatores, juntamente com a fidelidade relativamente baixa dos mecanismos de replicação e reparação do ADN mitocondrial, levam a uma taxa de mutação mais elevada do que o ADN nuclear. Com o tempo, esta alta taxa de mutação tornou o ADNmt um importante indicador para estudar os efeitos do stress ambiental e outros fatores danosos. A extração do ADN mitocondrial pode não só ajudar-nos a explorar profundamente a patogénese das doenças mitocondriais e fornecer pistas chave para o desenvolvimento de métodos de tratamento direcionados, mas também desempenhar um papel importante nos campos da medicina forense, antropologia e outros domínios.

Métodos tradicionais de isolamento de DNA mitocondrial

1) Ultracentrifugação de cloreto de césio

A ultracentrifugação com cloreto de césio é um método clássico e eficiente para extrair alta pureza. DNA mitocondrial (mtDNA). Esta tecnologia baseia-se no princípio da centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio e pode separar efetivamente moléculas de DNA de diferentes densidades. A seguir estão os passos detalhados após a otimização, descrevendo como usar a ultracentrífuga de cloreto de césio para extrair mtDNA:

Materiais e reagentes

Cloreto de césio (CsCl)
Brometo de Etídio (EtBr): Usado para coloração de DNA para fácil observação sob luz ultravioleta.
tubo de centrífuga
ultracentrífuga
lâmpada ultravioleta
Quantidade apropriada de tampão (geralmente tampão PBS ou TE)
Reagente de digestão enzimática (opcional, para digestão de ADN não mtDNA)

Passos de extração

Lise celular: Coloque células ou amostras de tecido em um tampão de lise adequado. Utilize métodos mecânicos ou químicos (como ultrassom, ciclos de congelamento-descongelamento ou o uso de agentes lisantes) para destruir as membranas celulares e liberar as mitocôndrias.
Centrifugação preliminar: Remova os detritos celulares e as células não disrompidas através de centrifugação a baixa velocidade (aproximadamente 1000 g, 10 minutos).
O sobrenadante foi recolhido, o qual continha mitocôndrias.
Preparação mitocondrial: O sobrenadante foi centrifugado a alta velocidade (aproximadamente 10000 g, 15 minutos) para precipitar as mitocôndrias.
Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet mitocondrial em uma pequena quantidade de PBS ou tampão TE.
Adicionar cloreto de césio e corante: Adicione cloreto de césio e uma pequena quantidade de brometo de etídio (EtBr) à suspensão mitocondrial. O brometo de etídio liga-se ao DNA, tornando o DNA visível sob luz ultravioleta. Ajuste a densidade da mistura para garantir que o DNA esteja corretamente estratificado no gradiente de densidade de cloreto de césio.
Ultracentrifugação: Transfira a mistura para tubos de ultracentrifugação e centrifugue (cerca de 100.000 g ou mais, o que geralmente leva várias horas a uma noite). Durante a centrifugação, o DNA será estratificado com base na sua densidade, e o DNA mitocondrial (mtDNA) e o DNA nuclear são separados devido às diferentes densidades.
Extração de DNA: Use uma luz ultravioleta para inspecionar o tubo de centrífuga e localizar a banda de DNA fluorescente. Aspire cuidadosamente as bandas que contêm mtDNA (geralmente localizadas em áreas mais claras porque o mtDNA é menor que o DNA nuclear). Transfira o mtDNA extraído para um novo recipiente.
Purificação de DNA: Utilize precipitação em álcool ou outros métodos de purificação de DNA para remover cloreto de césio e brometo de etídio. Re-suspenda o DNA em tampão TE ou outra solução adequada.

2) Cromatografia em coluna

A extração de DNA mitocondrial (mtDNA) por cromatografia em coluna é uma técnica eficaz de separação de biomoléculas que se baseia na interação entre uma fase estacionária (material da coluna) e uma fase móvel (buffer) para separar diferentes biomoléculas. Este método é particularmente útil na extração de mtDNA, pois reduz a contaminação do DNA nuclear e melhora a pureza do mtDNA. A seguir, estão os passos para extrair mtDNA utilizando cromatografia em coluna, incluindo os materiais necessários e os detalhes operacionais.

Materiais e reagentes

Buffer de lise: Geralmente contém surfactantes não iónicos para destruir membranas celulares.
Coluna de cromatografia: Comumente utilizados são a matriz de gel de sílica ou resina de troca iónica.
Buffer de eluição: o pH e a concentração de sal são ajustados para otimizar a eluição de DNA.
Tubo de centrífuga: Usado para coletar amostras eluídas.
Centrífuga: Usada para a remoção de amostras e etapas de eluição.
Tubo de microcentrífuga: Usado para coletar a solução final de DNA.
Etanol ou isopropanol: Usado para precipitação de DNA.
Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0): Usado para dissolver DNA purificado.

Passos de extração

Lise celular: Misture as células ou tecidos-alvo com o tampão de lise. Lise completamente as células e liberte as mitocôndrias através de métodos como agitação suave, ciclos de congelamento-descongelamento ou utilizando ultrassom.
Isolamento mitocondrial: Remova os detritos celulares e as células grandes não disruptas através de centrifugação a baixa velocidade (por exemplo, 1.000 × g, 10 minutos).
O sobrenadante é coletado e as mitocôndrias são então precipitadas por centrifugação de alta velocidade (por exemplo, 10.000 × g, 15 minutos). O sobrenadante foi descartado e as mitocôndrias precipitadas foram ressuspendidas em uma pequena quantidade de tampão de lise.
Extração de DNA: Adicione a quantidade apropriada de tampão de extração de ácidos nucleicos e protease K à suspensão mitocondrial para digerir a proteína e libertar o DNA. O DNA foi extraído utilizando o método de fenol-clorofórmio e, em seguida, precipitado com etanol ou isopropanol.
Purificação por cromatografia em coluna: Ressuspenda o DNA precipitado em um tampão apropriado e carregue-o em uma coluna de cromatografia em coluna previamente preparada. Elua substâncias adsorvidas de forma não específica com o tampão de eluição. Aumente gradualmente a concentração de sal no tampão de eluição para eluir especificamente o mtDNA. Colete o eluato, que contém mtDNA altamente puro.
Precipitação e ressuspensão de DNA: Adicione 2,5 volumes de etanol a 100% e 1/10 volumes de acetato de sódio a 3M ao eluído, misture e coloque a -20 °C durante a noite para precipitar o DNA. Após a precipitação por congelação, o precipitado de DNA é recolhido por centrifugação (por exemplo, 12.000 × g, 30 minutos, 4 °C). Descarte o sobrenadante, lave o precipitado de DNA pelo menos uma vez com etanol a 70% e, em seguida, centrifugue para recuperar o DNA. Deixe o precipitado de DNA secar ao ar ou seque-o brevemente a vácuo para evitar a secagem completa, o que dificulta a ressuspensão do DNA. O DNA seco foi ressuspendido em uma pequena quantidade de tampão TE, completamente dissolvido e armazenado a -20 °C.

Método DNase

A extração de DNA nuclear (ntDNA) com DNase é uma técnica eficaz que purifica o DNA nuclear utilizando DNase I, uma enzima que cliva especificamente o DNA, para digerir e remover o DNA mitocondrial (mtDNA) ou outro DNA não-alvo numa amostra. Este método é particularmente adequado para experiências que requerem DNA nuclear de alta pureza, como investigação genómica a nível cromossómico ou aplicações forenses. Os seguintes são os passos detalhados para a extração de DNA nuclear utilizando o método DNase:

Materiais e reagentes

DNase I: Uma enzima que cliva especificamente cadeias simples e duplas de DNA.
Buffer: O tampão de reação da DNase I é geralmente utilizado, e os componentes específicos são preparados de acordo com as instruções da enzima.
Buffer de lise: Usado para lise celular e libertação de ADN.
Proteinase K: Usado para digestão de proteínas para garantir a libertação de DNA.
Solução de fenol clorofórmio: Usada para extração e purificação de DNA.
Etanol ou isopropanol: Usado para a precipitação de DNA.
Buffer TE: Usado para ressuspensão de ADN.
Túbulos de centrifugação e túbulos de microcentrifugação: utilizados para processamento e recolha de amostras.
Centrífuga: Usada para várias etapas de centrifugação.
Banho de água com controlo de temperatura ou bloco de aquecimento: Usado para controlar a temperatura da etapa de tratamento enzimático.

Passos de extração

Lise celular: Coloque uma amostra de célula ou tecido num tubo de centrifugação contendo tampão de lise. Adiciona-se Proteinase K, geralmente a uma concentração de 100 μg/mL, ao tubo de centrifugação para digerir proteínas e libertar DNA. As amostras foram incubadas a 56°C durante várias horas ou durante a noite para lisar completamente as células.
Processamento com DNase I: Preparar a solução de DNase I: Preparar o tampão de reação de DNase I de acordo com as instruções do fabricante e adicionar DNase I (geralmente 1-10 unidades/μg de DNA). Adicionar a solução de DNase I à amostra lisada e misturar bem. Incubar a 37°C durante um tempo apropriado (geralmente de 30 minutos a 1 hora) para permitir que a DNase I cleave completamente o mtDNA. A atividade da DNase I pode ser interrompida adicionando EDTA a uma concentração final de 10 mM, ou por outros métodos recomendados nas instruções.
Extração de DNA: Adicione um volume igual de solução de fenol clorofórmio à amostra processada, agite bem e depois centrifugue e separe as camadas. Transfira cuidadosamente a fase aquosa do sobrenadante que contém DNA para um novo tubo de centrifugação. Repita o passo de extração com fenol-clorofórmio se necessário para aumentar o efeito de purificação.
Precipitação de DNA: Adicione 0,1 volumes de acetato de sódio 3M e 2,5 volumes de isopropanol a 100% ao sobrenadante. Após a mistura, refrigere a -20 °C durante a noite para promover a precipitação do DNA. No dia seguinte, o precipitado de DNA é coletado por centrifugação (por exemplo, 12.000 × g, 30 minutos, 4 °C), o sobrenadante é descartado e o precipitado é lavado com etanol a 70%. Deixe secar ao ar ou aqueça suavemente até que o precipitado de DNA esteja apenas seco para evitar secagem excessiva e, em seguida, ressuspenda o DNA com a quantidade apropriada de tampão TE.

4) Procedimento de lise alcalina

O método de desnaturação alcalina é um método simples, rápido e de baixo custo para extrair DNA mitocondrial (mtDNA), que é especialmente adequado para experimentos em pequena escala e investigação preliminar. Este método baseia-se nas características de dissociação do DNA em condições alcalinas. O mtDNA pode ser efetivamente liberado e purificado através de um tratamento alcalino simples, especialmente quando extraído de culturas celulares ou de um pequeno número de amostras de tecido. A seguir estão os passos detalhados para extrair mtDNA utilizando o método de desnaturação alcalina:

Materiais e reagentes

NaOH (hidróxido de sódio): A concentração comum é de 50 mM.
EDTA: Concentração final de 1 mM, utilizado para quelar iões metálicos e prevenir a atividade da DNase.
Tris-HCl: Usado para neutralizar soluções de DNA, pH 8.0, geralmente a uma concentração de 1M.
Etanol a gelo: Usado para a precipitação de DNA.
Buffer TE: Para ressuspensão de DNA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0.
Túbulos de microcentrífuga.
Centrífuga.
Misturador em vórtice.
Banho-maria ou bloco de aquecimento: Usado para aquecer amostras.

Passos de extração

Preparação da amostra: Colete amostras de células ou tecidos em tubos de microcentrífuga. Adicione a quantidade apropriada de tampão PBS e remova o excesso de tampão e impurezas por centrifugação (3000 × g, 5 minutos).
Tratamento alcalino: Adicione uma mistura de 50 mM NaOH e 1 mM EDTA à amostra, com um volume de aproximadamente 100-200 μL, dependendo do tamanho da amostra. Após uma breve mistura em vortex, a amostra foi aquecida em banho-maria a 95°C durante 10-30 minutos para permitir a liberação completa do DNA.
Reação de neutralização: Retire a amostra do bloco de aquecimento e adicione imediatamente um volume igual de Tris-HCl 1M, pH 8.0 para a neutralizar.
Após misturar, agite brevemente e arrefeça rapidamente à temperatura ambiente.
Precipitação de DNA: Adicione 2-2,5 volumes de etanol frio a gelo à amostra neutralizada e misture bem.
Congele a mistura a -20 °C durante pelo menos 2 horas ou durante a noite para maximizar a precipitação de DNA.
Coletar DNA: Centrifugar a amostra a 12000 × g durante 15 minutos a 4°C para coletar o precipitado de DNA. O sobrenadante foi descartado, o precipitado de DNA foi lavado com etanol a 70% frio, e o passo de centrifugação foi repetido. Descartar o sobrenadante novamente e secar ao ar o precipitado de DNA para evitar secagem excessiva.
Resuspender DNA: Resuspenda o pellet de DNA seco na quantidade apropriada de tampão TE. Dissolva completamente o DNA agitando suavemente ou deixando-o à temperatura ambiente durante várias horas.

Tecnologia emergente de isolamento de ADN mitocondrial

Método de separação por esferas magnéticas

O método de separação por beads magnéticos é uma tecnologia inovadora para a separação de DNA mitocondrial. O seu mecanismo único baseia-se na interação de ligandos específicos modificados na superfície dos beads magnéticos com as mitocôndrias ou o DNA mitocondrial. Os beads magnéticos são geralmente compostos por materiais magnéticos (como magnetite ou óxido de ferro magnético) com uma superfície funcional modificada com ligandos que podem ligar-se especificamente às mitocôndrias ou ao DNA mitocondrial. Estes ligandos podem ser anticorpos, aptâmeros de ácidos nucleicos, etc. Tomando como exemplo beads magnéticos modificados com anticorpos, os anticorpos podem ligar-se especificamente a proteínas específicas na superfície das mitocôndrias. Quando os beads magnéticos são adicionados ao lisado celular, os anticorpos na superfície dos beads magnéticos reconhecem e ligam-se à proteína-alvo na superfície das mitocôndrias, formando um complexo bead magnético-mitocondrial. Sob a ação de um campo magnético externo, o complexo bead magnético-mitocondrial mover-se-á em direção ao pólo magnético e será separado de outras impurezas. Desta forma, as mitocôndrias podem ser separadas rapidamente e de forma eficiente dos lisados celulares. Se o DNA mitocondrial for isolado diretamente, podem ser utilizados beads magnéticos modificados com aptâmeros de ácidos nucleicos que podem ligar-se especificamente ao DNA mitocondrial. Os aptâmeros podem ligar-se a sequências específicas do DNA mitocondrial, alcançando assim a captura seletiva do DNA mitocondrial.

Método de separação baseado em kits

Os kits de isolamento de DNA mitocondrial comuns disponíveis no mercado têm os seus próprios princípios de funcionamento e procedimentos operacionais. Kits baseados no princípio da adsorção em membrana de gel de sílica são amplamente utilizados. Tomando como exemplo um determinado tipo de kit de isolamento de DNA mitocondrial, o seu processo operacional é o seguinte: Primeiro, as amostras celulares são recolhidas e centrifugadas para remover o meio de cultura. Em seguida, adiciona-se uma quantidade adequada de tampão de lise celular, que contém ingredientes especiais que podem destruir as membranas celulares e libertar o citoplasma e as mitocôndrias. Os detritos celulares e as partículas grandes são então removidos por uma etapa de centrifugação, e o lisado celular é transferido para uma coluna de centrifugação contendo uma membrana de gel de sílica. Em condições de alta salinidade, o DNA mitocondrial será especificamente adsorvido na membrana de gel de sílica, enquanto outras impurezas fluirão para fora com o eluente. A membrana de gel de sílica é então lavada com um tampão de lavagem para remover impurezas residuais. Finalmente, o DNA mitocondrial adsorvido na membrana de gel de sílica é eluído com um tampão de eluição de baixa salinidade. Este kit baseado na adsorção em membrana de gel de sílica é relativamente simples de operar, pode remover efetivamente o DNA nuclear e outros poluentes, e é adequado para o processamento de amostras em grande escala.

Figura 1. O DNA celular total é isolado para fins de controlo. (Quispe-Tintaya, W., et al., 2013)

Existem vários métodos para extrair DNA mitocondrial (mtDNA), incluindo ultracentrifugação, cromatografia em coluna, tratamento com DNase e desnaturação alcalina, cada um com as suas próprias vantagens e desvantagens. A ultracentrifugação tem alta pureza, mas uma operação complexa; a cromatografia em coluna reduz a contaminação por DNA nuclear; o método DNase melhora a pureza do DNA nuclear; e o método de desnaturação alcalina é simples, mas pode afetar a integridade. Como uma tecnologia emergente, o método de separação por esferas magnéticas tem as vantagens de rapidez e eficiência. Escolher o método certo é crucial para a precisão do estudo.

Referência:

1. Quispe-Tintaya, W., White, R. R., Popov, V. N., Vijg, J., & Maslov, A. Y. (2013). Isolamento rápido de ADN mitocondrial de células mamíferas para sequenciação de nova geração. BioTechniques, 55(3), 133–136. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o e terei o prazer de traduzir.