O que é Genotipagem?

Genotipagem, uma ferramenta indispensável na genética moderna, oferece informações sobre a composição genética de um indivíduo. Este processo envolve a identificação de variações genéticas dentro do genoma de um organismo, fornecendo informações cruciais para várias áreas, incluindo medicina, agricultura e investigação.

Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNPs)

Um dos elementos fundamentais da genotipagem é polimorfismos de nucleótido único (SNPs), que são variações em uma única base nucleotídica dentro da sequência de ADN. Estes SNPs servem como marcadores genéticos e desempenham um papel vital na compreensão da diversidade genética e da suscetibilidade a doenças.

Polimorfismos de nucleótido único (SNPs) são variações em uma única base de nucleótido dentro do genoma, abrangendo substituições, inserções, deleções e formando marcadores genéticos. Embora teoricamente cada locus de SNP possa ter quatro variantes diferentes, na prática, apenas dois tipos ocorrem: transições e transversões, numa proporção de 2:1. SNPs aparecem com mais frequência em sequências de CG, com C muitas vezes a converter-se em T devido à desaminação induzida por metilação da citosina em timina.

Os SNPs são geralmente considerados como tendo uma frequência de variação superior a 1%. No genoma humano, aproximadamente a cada 1000 bases existe um SNP, totalizando cerca de 3 milhões de SNPs no genoma humano. Consequentemente, os SNPs servem como marcadores genéticos de terceira geração, potencialmente associados a várias diferenças fenotípicas, respostas a medicamentos ou suscetibilidades a doenças.

Os SNPs, dependendo da sua localização dentro dos genes, podem ser categorizados em regiões codificantes, regiões não codificantes e regiões intergénicas. Enquanto sinónimos SNPs em regiões codificadoras não alteram sequências de proteínas, SNPs não sinónimos resultam em alterações na sequência de aminoácidos. SNPs fora das regiões codificadoras de proteínas podem ainda influenciar a expressão génica, afetando processos como splicing, ligação de fatores de transcrição, degradação de mRNA ou sequências de RNA não codificantes, levando a polimorfismos de nucleótido único de expressão (ESNPs).

Inserções e Eliminações

Além dos SNPs, genotipagem também envolve a deteção de inserções e deleções (INDELs) no genoma. Os INDELs são variações onde bases nucleotídicas são adicionadas ou removidas da sequência de DNA, contribuindo para a diversidade genética e fenótipos de doenças.

Para que é utilizado o genotipagem?

A genotipagem encontra aplicações em vários campos:

• Investigação Clínica: Desempenha um papel fundamental na identificação de predisposições genéticas a doenças, na desvendar das complexidades da genética populacional e na elaboração de terapias direcionadas. Por exemplo, em Tipagem HLA, genotipagem os ensaios oferecem uma sensibilidade e precisão superiores em relação aos métodos tradicionais, permitindo a deteção de uma gama mais ampla de subtipos.
• Diagnósticos Clínicos: Genotipagem é indispensável para diagnosticar distúrbios genéticos, prognosticar riscos de doenças e personalizar planos de tratamento para pacientes individuais, inaugurando assim uma nova era da medicina personalizada.
• Agricultura: Dentro da agricultura, genotipagem assume uma importância crítica para programas de melhoramento, iniciativas de melhoria de culturas e compreensão da genética das plantas. Ao integrar dados de variação genómica com informações fenotípicas, os cientistas estão a abrir caminho para o melhoramento de precisão e estratégias de design molecular. Esta integração facilita previsões genéticas mais precisas relacionadas com características como qualidade, rendimento e tolerância ao stress, levando, em última análise, ao desenvolvimento de variedades de culturas resilientes e de alto rendimento.

Como Funcionam os Diferentes Métodos de Genotipagem?

• Genotipagem por PCR

A Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica amplamente utilizada que amplifica sequências específicas de ADN, permitindo a detecção de SNPs, INDELs e outras variações genéticas.

KASP (PCR Alelo-Específica Competitiva) permite a determinação precisa de alelos duplos para SNPs e InDels em loci alvo em diversas amostras de DNA genómico.

No reino de Genotipagem de SNPsA tecnologia KASP dominou rapidamente o mercado devido à sua flexibilidade, precisão e custo-efetividade excepcionais desde a sua criação. Tornou-se uma ferramenta auxiliar fundamental para identificar recursos de germoplasma, realizar análises populacionais e facilitar várias iniciativas de pesquisa.

• Microarranjos de DNA

Os microarrays permitem a genotipagem de alto rendimento ao detetar variações genéticas em milhares de sequências de ADN simultaneamente.

Microarranjos de ADN são novas ferramentas de deteção de variações de sequência de DNA. Elas exploram a hibridação específica do DNA alvo com sondas oligonucleotídicas densamente dispostas em suportes sólidos para identificar alelos SNP.

Vantagens: Alta capacidade de processamento e versatilidade, acomodando diversos propósitos de genotipagem e tamanhos de amostra.

Desvantagens: Dependente da escolha da plataforma de microarray e dos custos associados.

• Método de Sonda Fluorescente TaqMan

Tecnologia TaqMan, desenvolvido pela ABI, é uma técnica de genotipagem de SNP. Durante a PCR, duas sondas marcadas com diferentes fluoróforos ligam-se especificamente a diferentes alelos. À medida que a DNA polimerase se estende, o fluoróforo reportador é clivado, emitindo fluorescência. Os genótipos de SNP são determinados com base nos sinais de fluorescência detectados.

Vantagens: Operação simples, alta precisão e facilidade de interpretação.

Desvantagens: Síntese de sondas que consome tempo, tipicamente subcontratada à ABI.

• Genotipagem de SNPs MassARRAY

A utilização da espectrometria de massas permite identificar com precisão as variações de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) dentro do genoma. Genotipagem MassARRAY utiliza espectrometria de massas MALDI-TOF (Desorção/Ionização Assistida por Laser em Matriz Tempo de Voo), que analisa bases individuais com base na sua massa. O princípio subjacente a esta análise é a deteção de variações de bases em locais SNP específicos, discernindo a disparidade de massa das bases individuais. A faixa de massa detectável varia entre aproximadamente 4500 a 9000 Da (Daltons).

Vantagens

Alto Rendimento: Acomoda até 40 multiplexos dentro de um único tubo, facilitando um processamento eficiente.

Custo-Efetividade: Elimina a necessidade de modificações como sondas fluorescentes, reduzindo assim as despesas gerais.

Ciclo de Tempo Curto: Desde a conversão de DNA até à reportação de dados, o processo pode ser concluído em 8-10 horas, garantindo resultados rápidos.

Alta Precisão e Sensibilidade na Digitação: Fornece resultados de tipagem de SNP precisos e sensíveis.

Desvantagens

Instrumentação Especial Necessária: Requer instrumentação especializada para a implementação.

Âmbito de Detecção Limitado: Incapaz de identificar mutações desconhecidas, restringindo a sua utilidade em certos contextos.

Requisitos de Amostras e Loci: Impõe critérios específicos para amostras e loci por teste, o que pode restringir a flexibilidade e a escalabilidade.

• Método de Detecção SNaPshot Multiplexo

tecnologia SNaPshot, também conhecido como minissequenciação, assemelha-se à sequenciação de primeira geração. Numa sistema de reação contendo DNA polimerase, quatro ddNTPs marcados com fluorescência e primers de extensão de diferentes comprimentos adjacentes a loci SNP, a extensão termina após a incorporação de um único nucleótido.

Vantagens: Flexível, permitindo o design de primers de extensão de diferentes comprimentos para genotipagem de múltiplos SNPs numa única reação.

Desvantagens: Custo mais elevado.

• Genotipagem por Sequenciação

Sequenciação de próxima geração as plataformas fornecem dados genómicos abrangentes, permitindo a identificação de SNPs, INDELs e variações estruturais.

Muitos investigadores ainda optam pelo método de sequenciação direta ao estudar loci SNP. O princípio da sequenciação Sanger, também conhecido como método de terminação dideóxi, estende fielmente a sequência de nucleotídeos ao longo da fita molde. As ocorrências de SNP manifestam-se como padrões de pico nos resultados da sequenciação.

métodos de deteção de SNP de alto rendimento abrangem principalmente reessequenciação do genoma completo (WGS), microarranjos SNP e sequenciação genómica simplificada.

Re-sequenciamento do genoma completoWGS) oferece uma cobertura abrangente dos locais de mutação dentro do genoma, mas vem com um alto custo de sequenciação. Os microarrays de SNP estão limitados pelo número de marcadores de deteção e só conseguem identificar mutações existentes. Por outro lado, a tecnologia de sequenciação genómica simplificada possui uma gama mais ampla de locais de deteção e não está limitada por espécies, no entanto, a sua cobertura genómica permanece relativamente baixa, cerca de 2%.

Sequenciação de captura direcionada e reessequenciamento de genoma completo de baixa cobertura (LcWGS) apresentar uma abordagem convincente para maximizar a relação preço de digitação enquanto assegura uma triagem precisa. Esta abordagem investiga de forma eficiente os recursos de germoplasma tanto a nível de biologia molecular como de utilização em melhoramento, promovendo assim avanços nas práticas de melhoramento molecular.

Vantagens: O sequenciamento direto é o mais intuitivo e preciso. Genotipagem de SNPs método, adequado para descobrir loci SNP desconhecidos e detectar tamanhos de amostra pequenos ou um número limitado de sítios polimórficos.

Desvantagens: Vazão limitada e custos relativamente elevados. No entanto, com o rápido desenvolvimento das tecnologias de sequenciação de alto rendimento, até mesmo a sequenciação de alto rendimento de fragmentos direcionados ou genomas inteiros revitaliza o método de sequenciação direta.

Conclusão

Genotipagem revoluciona a nossa compreensão da genética e das suas aplicações em diversas disciplinas. Desde a medicina personalizada até os avanços agrícolas, a genotipagem capacita investigadores e profissionais a tomar decisões informadas com base no perfil genético de um indivíduo ou de uma população.

Perguntas e Respostas

• Como é que a genotipagem contribui para a medicina personalizada?

A genotipagem permite aos clínicos identificar variações genéticas associadas à suscetibilidade a doenças e à resposta a medicamentos, facilitando estratégias de tratamento personalizadas adaptadas a pacientes individuais.

• Qual é o papel da genotipagem na melhoria das culturas?

Na agricultura, a genotipagem ajuda os criadores a identificar características genéticas desejáveis, acelerando o desenvolvimento de culturas com maior rendimento, resistência a doenças e conteúdo nutricional melhorado.

• Quais são as limitações das tecnologias de genotipagem?

Enquanto tecnologias de genotipagem oferecem informações valiosas sobre variações genéticas, podem ter limitações na deteção precisa de variantes genéticas raras ou complexas. Além disso, considerações éticas relacionadas à privacidade e ao consentimento são cruciais ao utilizar informações genéticas para fins de investigação ou clínicos.