Diretrizes para Submissão de Amostras
Escolhendo Métodos de Enriquecimento de eccDNA: Digestão com Exonuclease, RCA, Captura e Controlo
Selecionar a estratégia certa de enriquecimento de eccDNA é, na sua essência, um compromisso entre especificidade e rendimento. Limpezas baseadas em exonucleases podem oferecer uma especificidade rigorosa ao remover DNA linear; a amplificação em círculo rolante (RCA) aumenta a sensibilidade, especialmente para pequenos círculos, à custa de viés de amplificação; a captura híbrida restringe o alcance a alvos conhecidos com um forte sinal-ruído; e abordagens derivadas de ATAC reutilizam dados existentes com chamadas algorítmicas. O princípio organizador mais importante para escolher entre estes métodos de enriquecimento de eccDNA é o seu objetivo de pesquisa: Descoberta versus Alvo.
Se estiver a realizar uma descoberta—perfilando um repertório amplo e muitas vezes desconhecido de eccDNA através de loci e tamanhos—geralmente tolerará algum viés para ganhar sensibilidade e amplitude. Se o seu objetivo é a validação ou quantificação direcionada de loci conhecidos (por exemplo, círculos associados a oncogenes), irá preferir métodos que ofereçam especificidade, um tempo de resposta previsível e controlos limpos e publicáveis.
Este guia complementa o nosso Fluxo de Trabalho Experimental geral para sequenciação de eccDNA, focando na seleção de métodos e nas restrições práticas. Para uma visão geral passo a passo do fluxo de trabalho (preparação da biblioteca, enriquecimento, armadilhas), consulte o artigo sobre o Fluxo de Trabalho Experimental nesta série: Fluxo de Trabalho Experimental para Sequenciação de eccDNA: Enriquecimento, Preparação de Biblioteca e Armadilhas Comuns.
- Métricas de qualidade e QC para estudos de eccDNA — pontos de verificação na preparação da biblioteca e prontidão para a execução. Controlo de Qualidade da Preparação de Bibliotecas NGS.
Métodos de Enriquecimento de eccDNA: Como Escolher entre Descoberta e Alvo
Antes de mergulhar em protocolos individuais, é útil ancorar a tomada de decisões na dimensão Descoberta vs Direcionada e nas realidades do tipo de amostra e da integridade do DNA.
- Descoberta: Maximize a sensibilidade e a abrangência. Aceite algum viés de tamanho e planeie validação ortogonal. Pilha típica: limpeza com exonuclease + RCA, seguida de sequenciação de leituras curtas e filtragem computacional; confirmação de leituras longas para grandes círculos.
- Direcionado: Maximizar a especificidade e a interpretabilidade para loci conhecidos. Preferir fluxos de trabalho de captura híbrida e amplicon em bibliotecas limpas por exonuclease; evitar RCA sempre que possível para minimizar o viés.
Pense na enriquecimento de eccDNA como sintonizar uma rádio: a RCA amplifica tudo na faixa com um aumento nos sinais de alta frequência (círculos pequenos), enquanto a captura híbrida sintoniza uma estação específica (locais conhecidos) e mantém o ruído baixo. A limpeza com exonuclease é o seu filtro de ruído antes de qualquer amplificação.
Método 1: Digestão Exonucleásica (O Padrão)
A digestão por exonuclease é a limpeza fundamental utilizada em protocolos de eccDNA para remover DNA linear e enriquecer moléculas circulares antes da amplificação ou preparação de bibliotecas. Mecanicamente, enzimas como a Exonuclease V (RecBCD) degradam DNA duplex linear em ambas as direções, deixando intactos os moldes circulares que não possuem extremidades livres. A combinação da ExoV com DNases dependentes de ATP (por exemplo, Plasmid-Safe) reduz ainda mais os contaminantes lineares residuais.
Como funciona (mecanismo)
A exonuclease V tem como alvo extremidades de dsDNA linear e ssDNA, digerindo-as de forma processiva. O DNA circular forma estruturas fechadas sem extremidades acessíveis, tornando-o refratário à digestão pela ExoV em condições padrão. Muitos laboratórios adicionam opcionalmente DNase dependente de ATP Plasmid-Safe como um passo adicional para degradar quaisquer fragmentos lineares remanescentes após workflows de ligadura ou circularização parcial. Estes passos, em conjunto, melhoram a razão circular-para-linear antes da análise ou amplificação subsequente.
Os detalhes mecanicistas e as propriedades dos reagentes estão documentados na literatura dos fornecedores de enzimas e em revisões de métodos, por exemplo, nas informações sobre o produto Exonuclease V da NEB e nas comparações de métodos. Veja a visão geral geral em análises comparativas de metodologias de eccDNA (2024) e a documentação técnica ExoV da NEB: Página de produto da Exonuclease V (RecBCD) da NEB.
Quando usá-lo
- Objetivos de descoberta: Usar como um passo de limpeza antes da RCA para reduzir os templates lineares e aumentar a proporção de leituras derivadas de eccDNA.
- Objetivos direcionados: Usar antes dos fluxos de trabalho de captura híbrida ou amplicon para reduzir o fundo e melhorar a eficiência de captura no alvo.
- Tipos de amostras: Funciona melhor com ADN genómico de alto peso molecular (HMW) (linhas celulares de alta integridade). Entradas fragmentadas (FFPE, pequenas biópsias) podem ainda beneficiar, mas espere um rendimento inferior; ajuste os tempos de digestão e as unidades com cautela.
Micro-protocolo (dependente do laboratório; titulação piloto recomendada)
- DNA de entrada: 0,5–2 µg de DNA genómico HMW no tampão do fornecedor.
- Adicionar ExoV por unidades de fornecedor/µg (seguir as orientações do kit); incubar a 37°C durante 30–60 minutos.
- Opcional: Adicione DNase dependente de ATP, seguro para plasmídeos, com ATP; incube durante 30–60 minutos.
- Limpeza: Realizar a purificação com esferas magnéticas (relação SPRI de 1,3× a 1,8× dependendo da seleção de tamanho desejada). Eluir em 10 mM Tris-HCl, pH 8,5.
- Limpeza opcional secundária: Se os inibidores persistirem, repita a limpeza com esferas ou realize uma limpeza em coluna.
Para considerações gerais sobre a preparação de bibliotecas (distribuições de tamanho de fragmentos, molaridade, pontos de controlo de QC), veja Controlo de Qualidade da Preparação de Bibliotecas NGS.
Controlo e QC
- Controlo negativo: Uma digestão simulada sem enzima para estimar o fundo.
- Controlo positivo: Inclua um pequeno plasmídeo ou amplicão circularizado adicionado a um número de cópias conhecido para quantificar a seletividade da digestão.
- Métricas de QC: qPCR/dPCR para medir a razão circular-para-linear; análise de fragmentos (Femto Pulse) para confirmar a integridade; concordância de réplicas para círculos chamados.
- Limiares de aceitação (dependentes do laboratório): aumento ≥3× na razão circular-para-linear após digestão; <20% das leituras alinhadas a fragmentos lineares canónicos na biblioteca enriquecida.
Prós e contras
Prós:
- Alta especificidade para remover DNA linear; melhora a relação sinal-ruído a montante.
- Precursor flexível para RCA, captura híbrida ou validação de amplicão.
Contras:
- Requer entrada HMW para melhor desempenho; amostras fragmentadas produzem uma recuperação circular inferior.
- O custo das enzimas e a variabilidade entre lotes podem exigir titulação.
Lista de verificação para resolução de problemas
- A digestão excessiva reduzindo o rendimento circular? Reduza as unidades de enzima ou o tempo de incubação; verifique as condições do tampão.
- DNA linear residual? Adicione um passo PSAD ou repita o ExoV com unidades ajustadas; verifique a fonte de ATP para o PSAD.
- Baixa recuperação de FFPE? Considere digestões mais curtas, ajuste as proporções de esferas para favorecer fragmentos maiores ou mude para captura direcionada para validação.
- Replicados inconsistentes? Padronize as verificações de integridade de entrada e realize digestões simuladas emparelhadas para avaliar a variabilidade.
Método 2: Amplificação por Círculo Rolante (RCA) com Phi29
A RCA é a força de trabalho para a caracterização orientada para a descoberta. Usando a polimerase de DNA Phi29, a RCA amplifica DNA circular isotermicamente por deslocamento de fita, gerando longos concatâmeros que se traduzem em leituras abundantes após fragmentação e preparação da biblioteca.
- Amplificação em círculo rolante eccDNA
Como funciona (mecanismo)
A polimerase Phi29 exibe forte deslocamento de cadeia e alta processividade, tornando-a ideal para amplificar modelos circulares. A iniciação é tipicamente realizada com hexâmeros aleatórios, às vezes modificados para resistir a exonucleases. O resultado é uma replicação contínua em torno do círculo, produzindo longos concatâmeros compostos por unidades repetidas do modelo circular.
Os documentos de métodos documentam o uso generalizado de RCA em fluxos de trabalho derivados de Circle-Seq; para uma ampla análise de desempenho e limitações, consulte a análise comparativa de 2024: Análise comparativa de metodologias de eccDNA, e uma aplicação representativa do Circle-Seq: Caracterização em todo o genoma de eccDNA (2023).
Viéses conhecidos e por que são importantes
- Viés de tamanho: a RCA amplifica preferencialmente círculos pequenos (geralmente <2–10 kb), causando uma sobre-representação dessas espécies em relação a círculos maiores.
- Artefactos de cobertura: Bibliotecas derivadas de RCA frequentemente apresentam picos de cobertura acentuados e padrões periódicos correspondentes a repetições de concatémeros.
- Caveats de quantificação: As estimativas do número de cópias baseadas em bibliotecas amplificadas por RCA podem representar de forma errada a verdadeira abundância; favorecer a quantificação relativa, e não a absoluta.
As estratégias de mitigação incluem a redução dos tempos de amplificação (por exemplo, 2–4 horas), a afinação da química dos primers, a combinação da RCA com a limpeza prévia por exonuclease e a aplicação de filtros bioinformáticos para remover artefatos induzidos por concatâmeros. Para orientações sobre amplificação isoterma e documentação de kits, consulte os recursos do fornecedor, como Kit RCA phi29-XT da NEB.
Micro-protocolo (dependente do laboratório; titulação piloto recomendada)
- DNA de entrada: 10–100 ng de DNA enriquecido em forma circular.
- Priming: Hexâmeres aleatórios resistentes a exonuclease (quando disponíveis) nas concentrações recomendadas pelo fornecedor; pirofosfatase opcional para suprimir a depleção de dNTP.
- Amplificação: 30°C durante 2–4 horas (otimizar de acordo com a entrada e o viés observado). Evitar a sobre-extensão, que aumenta o risco de artefatos.
- Processamento pós-RCA: Cortar para 200–500 bp (enzimático ou sonicação) e prosseguir para a preparação da biblioteca compatível com Illumina.
- Opcional: Incluir um breve passo de exonuclease após a RCA se produtos linearizados contaminarem, mas ter cuidado para não degradar produtos genuínos derivados de concatâmeros circulares.
Controlo e QC
- Círculos de spike-in de tamanhos definidos (por exemplo, 300 bp, 1 kb, 3 kb) para quantificar o viés de tamanho.
- Controles negativos sem RCA para estimar o fundo.
- QC baseado em cobertura: Avaliar taxas de cobertura e duplicação semelhantes a picos; garantir a concordância entre réplicas.
- Limiares de aceitação (dependentes do laboratório): Taxa de duplicação dentro da faixa esperada para bibliotecas RCA; recuperação detectável de círculos spike-in em diferentes tamanhos com viés conhecido a favor dos menores.
Prós e contras
Prós:
- Excelente sensibilidade para a descoberta de baixas entradas; particularmente forte para pequenos círculos.
- Fluxo de trabalho isotérmico simples; reagentes amplamente disponíveis.
Contras:
- Favorar círculos menores pode distorcer perfis; a quantificação requer cautela.
- Os artefatos de concatenação complicam a interpretação da cobertura e a análise subsequente.
Lista de verificação para resolução de problemas
- Picos de cobertura excessiva? Reduza o tempo de RCA, ajuste a mistura de primers, reduza a complexidade de entrada com exonuclease anterior.
- Amplificação fraca a partir de entradas muito baixas? Verifique a qualidade dos primers e a atividade da polimerase; considere uma pré-limpeza para remover inibidores.
- Sobre-representação de círculos pequenos? Incorpore spike-ins com tamanhos conhecidos para quantificar e corrigir posteriormente o viés na análise.
- Falhas na preparação da biblioteca após a RCA? Assegure uma adequada fragmentação e limpeza, pois produtos de concatâmeros viscosos podem dificultar a ligação dos adaptadores.
Para informações sobre o contexto do método e do protocolo, consulte as páginas principais de serviços da CD Genomics para suporte prático e fluxos de trabalho de confirmação: Serviços de Genómica e Sequenciação de Longa Leitura.
Método 3: Abordagens Híbridas de Captura e Derivadas de ATAC
Os fluxos de trabalho de captura híbrida e derivados de ATAC servem principalmente a objetivos específicos—confirmar ou quantificar eccDNA/ecDNA suspeitos em loci conhecidos. A captura híbrida utiliza sondas biotiniladas para enriquecer sequências de interesse; a deteção derivada de ATAC aproveita bibliotecas baseadas em acessibilidade e chamadas algorítmicas.
Captura híbrida para painéis direcionados
A captura híbrida pode ser realizada em bibliotecas preparadas a partir de DNA limpo por exonuclease para melhorar as taxas de alvo e suprimir o fundo. Para loci de oncogenes conhecidos (por exemplo, EGFR, MYC), painéis de sondas personalizados podem direcionar regiões esperadas e, quando viável, sequências que abrangem junções. Como o eccDNA/ecDNA pode ser estruturalmente heterogéneo, o design do painel beneficia de redundância e inclui regiões flanqueadoras.
Divulgação: A CD Genomics é o nosso produto. Como um exemplo neutro e prático, pode operacionalizar painéis direcionados utilizando os recursos da CD Genomics sem alterar o seu design científico. Para informações sobre o design de painéis e fluxos de trabalho de captura, consulte Visão geral do sequenciamento direcionado, e para opções de implementação, veja Sequenciação do Exoma Humano e de RatoEstes serviços podem suportar designs de sondas personalizados para loci de eccDNA suspeitos e fluxos de trabalho de captura padrão compatíveis com estudos RUO.
Para validação baseada em amplicons, veja Serviços de Sequenciação de AmpliconsPara confirmação estrutural de leitura longa, consulte Sequenciação de Longa Leitura e Sequenciação Direcionada por Nanoporos.
Deteção derivada de ATAC (conceitos Circle-ATAC)
A deteção de eccDNA baseada em ATAC-seq foi demonstrada através da reanálise de bibliotecas de acessibilidade para assinaturas de junção circular. Isso evita a RCA e pode ser atraente quando já se têm conjuntos de dados ATAC profundos. Artigos metodológicos descreveram a validação por PCR inversa e a confirmação por FISH a partir de chamadas derivadas de ATAC. Para uma revisão acessível sobre a categorização de eccDNA em diferentes conjuntos de dados e abordagens, consulte Categorização de eccDNA em tecidos humanos (2024); para uma demonstração fundamental da deteção derivada de ATAC, veja Identificação de eccDNA baseada em ATAC-Seq (2021).
Ponteiros de micro-protocólo (captura híbrida; dependente do laboratório)
- Fonte da biblioteca: Preferir DNA limpo de exonuclease. Se a entrada for limitada, considerar kits de captura de baixo input e evitar RCA para reduzir o viés.
- Design de sondas: Incluir regiões em torno de junções suspeitas; adicionar redundância para pontos de quebra heterogéneos.
- Profundidade de sequenciamento: 5–20 milhões de leituras pareadas por amostra, dependendo do tamanho do painel; avaliar a fração em alvo e a uniformidade.
- Validação: PCR de junção/Sanger através de pontos de quebra previstos; nanopore de leitura longa para confirmação estrutural quando os painéis sugerem uma arquitetura complexa.
Prós e contras
Prós:
- Alta especificidade para alvos conhecidos; utilização eficiente do orçamento de sequenciação.
- Quantificação mais fácil em loci alvo com controlos limpos.
Contras:
- Riscos de perder círculos inesperados fora do painel.
- A heterogeneidade da junção pode desafiar o design da sonda; requer iteração.
Validação e Controlo
Independentemente do método, os estudos de eccDNA de qualidade de publicação dependem de controlos robustos e validação computacional. Esta secção descreve designs práticos que pode adoptar e aponta para recursos que cobrem os detalhes da análise.
Círculos sintéticos de spike-in
Desenhe spike-ins circulares sintéticos para quantificar a eficiência de enriquecimento e o viés. Escolha sequências ausentes do genoma hospedeiro para evitar ambiguidades de mapeamento e construa círculos em múltiplos tamanhos (por exemplo, ~300 bp, ~1 kb, ~3 kb). Adicione uma quantidade fixa às amostras antes do enriquecimento e meça a recuperação após o enriquecimento através de qPCR/dPCR e contagens de leituras de sequenciamento. Uma vez que os protocolos revisados por pares variam, os parâmetros são dependentes do laboratório; é aconselhável realizar uma titulação piloto.
Confirmação de PCR de junção e sequenciação
Valide o eccDNA previsto com PCR inversa através dos junctions, seguido de sequenciação Sanger do amplicon para confirmar o ponto de ruptura. Para círculos maiores ou estruturas de ecDNA suspeitas (>10 kb), realize sequenciação direcionada de leitura longa para verificar a continuidade do círculo e mapear arquiteturas complexas.
Validação computacional e filtragem de artefatos
Utilize pipelines estabelecidas para detectar junções circulares e filtrar artefatos típicos de bibliotecas baseadas em RCA. Pipelines como Circle-Map, ECCsplorer e o recente eccDNA-pipe integram a deteção de leituras divididas, verificações de continuidade de cobertura e limiares de pontuação. Uma análise comparativa de 2024 fornece referências para as sensibilidades dos métodos e artefatos comuns. Para um resumo dedicado dos passos computacionais e padrões de reporte, consulte o nosso artigo em série: Bioinformática para eccDNA: Algoritmos de Detecção, Filtragem de Artefatos e Normas de Reporte.
Métricas de QC que deve acompanhar
- Eficiência de enriquecimento: Rácio de recuperação circular para linear de spike-in antes/depois do enriquecimento.
- Frações de fundo: Proporção de leituras que mapeiam para regiões genómicas lineares em bibliotecas enriquecidas.
- Reprodutibilidade: Sobreposição de eccDNA chamado entre réplicas técnicas.
- Padrões de cobertura: Presença de picos induzidos por RCA vs cobertura uniforme em fluxos de trabalho apenas com exonuclease.
- Profundidade de sequenciação: Para descoberta, planeie 50–100M de leituras pareadas por amostra (dependente do laboratório). Para painéis direcionados, 5–20M de leituras, dependendo do tamanho do painel.
Para pontos de controlo de QC práticos durante a preparação e captura da biblioteca, veja Controlo de Qualidade da Preparação de Bibliotecas NGS.
Matriz de Decisão: Qual Escolher?
A decisão começa com o seu objetivo—Descoberta vs Direcionado—e é moldada pelo tipo de amostra e pela integridade do DNA. Abaixo está uma matriz compacta para orientar a seleção inicial.
| Objetivo | Tipo de Amostra | Método Recomendado | Requisito de Entrada | Viés Esperado | Considerações sobre a Reviravolta |
|---|---|---|---|---|---|
| Descoberta | Linha celular, ADN de alto peso molecular | Digestão por exonuclease + RCA | 0,5–2 µg de ADN → 10–100 ng após limpeza | Prefere círculos pequenos (<2–10 kb) | Moderado; RCA adiciona horas, padrão de preparação de biblioteca. |
| Descoberta | Biópsia/FFPE (baixa entrada) | RCA (tempo mais curto) ± limpeza com exonuclease | 10–50 ng | Forte viés de pequeno círculo; efeitos de fragmentação | Fluxos de trabalho moderados; requerem baixo input |
| Direcionado | Locais de oncogenes conhecidos (por exemplo, MYC) | Captura híbrida em bibliotecas limpas de exonuclease | ≥50 ng (dependente do painel) | Mínimo se o painel estiver bem desenhado. | Eficiente; a captura adiciona 1–2 dias. |
| Direcionado | Validação/quantificação rápida | Amplicon + PCR/junção Sanger; opcional leitura longa | 10–50 ng | Viés do método minimal; específico do locus | Rápido; dias, não semanas |
Para métricas de qualidade a incluir no seu desenho de estudo e avaliações de fornecedores, consulte o nosso artigo em série: Métricas de Qualidade para Sequenciação de eccDNA: Eficiência de Enriquecimento, Fundo e Reproduzibilidade.
Para desenhar experiências induzidas por stress (por exemplo, hidroxiureia, perturbações do ciclo celular) e compreender as implicações dos métodos, veja: Estresse de Replicação e eccDNA: Hidroxiureia, Efeitos do Ciclo Celular e Considerações sobre o Design do Estudo.
Figuras e Notas Práticas
Abaixo estão três figuras focadas nos profissionais para visualizar as principais diferenças entre os métodos e destacar o equipamento prático.
Figura 1: ExoV/Plasmid-Safe remove DNA linear, mantendo os templates circulares intactos. A RCA Phi29 amplifica círculos em concatémeros, aumentando o rendimento, mas introduzindo um viés de pequenos círculos.
Figura 2: As bibliotecas RCA frequentemente apresentam picos de cobertura acentuados (periodicidade) em locais de pequenos círculos, enquanto as bibliotecas não-RCA, limpas por exonuclease, exibem uma cobertura mais uniforme adequada para quantificação direcionada.
Figura 3: Suporte de separação de esferas magnéticas utilizado para limpeza. Ajuste as proporções de esferas para amostra (1,0×–1,8×) para selecionar os tamanhos de fragmentos desejados e remover enzimas/inibidores.
Orientação Prática Expandida: Cenários de Caso e Dicas
Para traduzir a matriz de decisão em ações de laboratório, aqui estão cenários concretos e dicas adaptadas a desenhos de estudo comuns.
Cenário 1: Descoberta em uma linha celular bem caracterizada (DNA HMW)
- Objetivo: Perfilamento amplo do repertório de eccDNA para gerar hipóteses.
- Recomendado: Digestão por exonuclease → RCA → sequenciação de leituras curtas; seguimento de leituras longas para círculos >10 kb.
- Dicas: Realize três réplicas técnicas para avaliar a reprodutibilidade. Utilize círculos de spike-in nas proporções de 0,1×, 1×, 10× para calibrar o viés. Mantenha a RCA a 3 horas para limitar picos de cobertura.
- Análise: Utilize o Circle-Map com um limiar de leitura dividida ≥2 e filtragem de pontuação de círculo; reporte a distribuição de comprimento e anotações genómicas.
Cenário 2: Descoberta em biópsia de baixo input/FFPE
- Objetivo: Detetar eccDNA em amostras escassas e fragmentadas.
- Recomendado: abordagem RCA em primeiro lugar com limitação cuidadosa de tempo; limpeza opcional com exonuclease suave se a integridade permitir.
- Dicas: Opte por kits de biblioteca de baixo input; aceite um aumento do viés em pequenos círculos; planeie validação direcionada para loci chave através de PCR de amplicão/Junction.
- Análise: Compare com o controlo não-RCA, se possível; quantifique a fração de fundo e as taxas de duplicação.
Cenário 3: Validação direcionada de eccDNA de oncogene suspeito
- Objetivo: Confirmar e quantificar círculos em loci específicos (por exemplo, MYC).
- Recomendado: Biblioteca limpa por exonuclease → painel de captura híbrida incluindo junções e flancos; evitar RCA para minimizar viés.
- Dicas: Desenhe sondas com redundância em torno dos pontos de quebra; valide com PCR de junção/Sanger; se for complexo, realize sequenciação de longo alcance direcionada por nanopore.
- Análise: Focar na fração em alvo, uniformidade de cobertura e leituras que abrangem junções; reportar estimativas de número de cópias com cautela.
Cenário 4: Quantificação rápida para um prazo (conferência/pôster)
- Objetivo: Produzir um sinal claro e reproduzível em um ou dois loci.
- Recomendado: Sequenciação de Amplicon e PCR/juncional Sanger em DNA limpo por exonuclease; opcional leitura longa para clareza estrutural.
- Dicas: Mantenha o fluxo de trabalho simples; priorize os controles e relatórios claros; evite RCA a menos que a entrada o exija.
- Análise: Fornecer confirmação direta da junção e replicar a concordância; incluir métricas de recuperação de spike-in no cartaz.
Dicas práticas em diferentes cenários
- Piloto inicial: Titrar unidades de enzima, tempos de RCA e razões de beads com um lote pequeno; bloquear parâmetros antes de escalar.
- Documente rigorosamente: Registe os números dos lotes, os tempos de incubação, os pontos de controlo de QC; a reprodutibilidade é o seu seguro de publicação.
- Plano de validação ortogonal: Combinar PCR em junção/Sanger com confirmação de leitura longa para descobertas chave.
- Orçamento para profundidade: Estudos de descoberta beneficiam de 50–100M de leituras PE; painéis direcionados muitas vezes são suficientes com 5–20M de leituras PE.
Conclusão: Escolher por Descoberta vs Direcionado
Se o seu objetivo é a descoberta, comece com a digestão por exonuclease seguida de RCA, aceite o viés de pequenos círculos como o custo da sensibilidade e planeie validação ortogonal (PCR de junção, confirmação de leitura longa) para descobertas chave. Se o seu objetivo é a validação ou quantificação direcionada, priorize a captura híbrida em bibliotecas limpas de exonuclease, incorpore ensaios específicos de junção e mantenha o seu controlo de qualidade rigoroso e reprodutível.
Se precisar de um parceiro de implementação neutro para captura direcionada ou sequenciação confirmatória, a CD Genomics apoia projetos RUO com painéis personalizados e confirmação de leitura longa. Serviços de Genómica.
Autor
Yang H. — Cientista Sénior, CD Genomics; Universidade da Florida.
Yang é um investigador em genómica com mais de 10 anos de experiência em investigação em genética, biologia molecular e celular, fluxos de trabalho de sequenciação e análise bioinformática. Habilidoso tanto em técnicas de laboratório como na interpretação de dados, Yang apoia o design de estudos RUO e projetos baseados em NGS.
Referências:
- Análise comparativa de metodologias de eccDNA e limiares de pipeline (2024): Gao et al., PMC11502736.
- Caracterização em todo o genoma de eccDNA com fluxos de trabalho derivados de RCA (2023): Jiang et al., PMC10300174.
- Deteção de eccDNA derivada de ATAC e validação (2021): Su et al., PMC8161110.
- Página do reagente NEB Exonuclease V (RecBCD): NEB M0345.
- Kit RCA phi29-XT da NEB e orientações para amplificação isotérmica: NEB E1603.
CTA suave: Contacte a CD Genomics para discutir painéis direcionados RUO ou confirmação de leitura longa para estudos de eccDNA: Serviços de Genómica.
