Destaque de Sistemas de Plantas e Modelos: Ciclo de Vida da Drosófila e Dinâmicas de eccDNA sob Estresse Nutricional em Arroz

O DNA circular extracromossómico (eccDNA) não é um fenómeno exclusivo dos humanos. Aparece em vários reinos—desde animais a plantas e fungos—sugerindo um conjunto conservado de mecanismos que geram e regulam o DNA circular durante o desenvolvimento e o stress. Se você encontrou principalmente eccDNA em artigos focados no câncer, comece aqui: os conceitos fundamentais na nossa visão geral da série. Sequenciação de eccDNA Explicada, contrastar uma perspetiva centrada no ser humano com contextos organismais mais amplos.

Este destaque compara dois casos de uso de sistemas modelo: o Caso A perfila a dinâmica potencial do eccDNA ao longo do ciclo de vida da Drosophila melanogaster (embrião → larva → pupa → adulto), e o Caso B examina o arroz (Oryza sativa) sob privação de fosfato. Metodologicamente, enfatizamos a deteção imparcial a partir de nativos. ATAC-seq ou WGS via sinais de leitura dividida e pares discordantes, depois validar círculos representativos com PCR inversa, FISH ou sequenciação seletiva de long-read. Onde necessário, estratégias de enriquecimento como Circle-seq e RCA são discutidas como complementos de validação em vez de caminhos de quantificação primários.

Caso A — Drosophila melanogaster: perfil de eccDNA ao longo do ciclo de vida

Conjuntos de dados diretos e resolvidos por estágio que catalogam eccDNAs ao longo da embriogénese de Drosophila, estágios larvais e pupais continuam a ser escassos. A evidência mais forte específica para o organismo reside atualmente em moscas adultas, especialmente em contextos de envelhecimento. Por exemplo, Yang e colegas relataram aumentos associados à idade na expressão de elementos transponíveis (TE) e acumulação de eccDNA em adultos de Drosophila, apoiados por sequenciação enriquecida em círculos e normalização por qPCR com spike-ins em 2022. Veja o artigo da PLOS Genetics, Paisagens de elementos transponíveis no envelhecimento de Drosophila (2022), que documenta assinaturas de eccDNA derivadas de TE e fornece uma ligação biologicamente plausível a alterações na cromatina em tecidos envelhecidos.

Mecanicamente, várias revisões inter-reinos descrevem como a junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ/alt-EJ), o stress de replicação e a atividade de transposões podem gerar eccDNA em diversos organismos. Estas vias são consistentes com a remodelação da cromatina que se sabe ocorrer durante o desenvolvimento de Drosophila, mesmo que catálogos de eccDNA específicos de embriões/lavas/pupas ainda estejam a emergir. Para um contexto mais amplo, veja revisões que sintetizam a formação e biologia de pequenos eccDNA e uma visão geral atualizada das categorias e biogénese, por exemplo. Desmistificando os círculos de DNA extrachromossómico (2022).

Do ponto de vista prático, os biólogos do desenvolvimento podem começar com ATAC-seq nativo ou WGS de coortes bem estagiadas e aplicar a deteção de junções em primeiro lugar:

• Procure leituras divididas que abrangem junções circulares e pares discordantes que indiquem circularização; o ATAC-seq demonstrou revelar milhares de eccDNAs em sistemas mamíferos através desses sinais, conforme documentado em O ATAC-seq identifica milhares de ADN circular extracromossómico (2020).
• Valide junções representativas por PCR inversa e FISH. Um protocolo passo a passo é descrito em Identificação de DNA Circular Extracromossómico Baseada em ATAC-Seq (2021).
• Evite sobreinterpretar picos de cobertura sem suporte de junção—especialmente perto de repetições. Quando for necessária uma resolução estrutural (por exemplo, círculos multi-fragmentados derivados de TE), adicione sequenciação de longas leituras seletivas ONT/PacBio para obter leituras abrangentes e desambiguar arquiteturas.

Anteriormente, explorámos o envelhecimento dos organismos como um contexto para as alterações do eccDNA somático. Para os leitores que ligam a discussão sobre o desenvolvimento com os fenótipos adultos, veja eccDNA em Células Somáticas e Pesquisa sobre Envelhecimento: O Que Sabemos e Como Perfilá-lo.

Nota neutra sobre a prática: Para equipas que realizam deteção nativa de ATAC-seq/WGS e que procuram bioinformática reprodutível, uma abordagem consultiva é útil. A CD Genomics oferece processamento de dados de ponta a ponta, anotação e visualização adequados para publicação. Veja Serviços de Bioinformática para uma visão geral de alto nível. (Divulgação: a CD Genomics é o nosso produto; apenas no contexto RUO.)

Figura 1. Ciclo de vida da Drosophila e tecidos amostrados para perfilagem de eccDNA.

Esquema do ciclo de vida de Drosophila melanogaster mostrando embrião, três instares larvais (glândulas salivares destacadas), pupa (discos imaginais) e adulto (gónadas e tecidos somáticos). A deteção a nível de junção (leituras divididas e pares discordantes) e a validação ortogonal (PCR inversa e/ou leituras longas abrangentes) foram utilizadas para avaliar a presença, composição e contribuições de elementos repetitivos do eccDNA em estágios específicos.

Design de estudo sugerido para o perfilamento do desenvolvimento de Drosophila

• Estadiamento e amostragem: Coletar embriões, larvas, pupas e coortes de adultos com critérios de estadiamento claros; triplicatas biológicas por estágio.
• Escolha da biblioteca: ATAC-seq para eccDNAs acessíveis à cromatina; WGS para uma cobertura mais ampla. A profundidade pode ser calibrada para detectar leituras que abrangem junções (por exemplo, 100M de leituras pareadas como ponto de partida para referências de ATAC-seq em sistemas mamíferos).
• Pipeline de deteção: Execute um fluxo de trabalho com prioridade para junções (por exemplo, módulos ecc_finder, ECCsplorer ou eccDNA-pipe) com limites rigorosos de leituras divididas e filtros de pares discordantes; exija ≥2 leituras de suporte a junções antes de sinalizar candidatos.
• Validação ortogonal: Selecione um subconjunto de junções por estágio para PCR inverso e considere a FISH em tecidos onde a visualização ajuda à interpretação.
• Relatório: Entregar listas de junções (BED/VCF/CSV), gráficos de distribuição de tamanhos, anotações de sobreposição de elementos transponíveis e notas de método/versão que permitam a reprodutibilidade.

Hipóteses de regulação do desenvolvimento (porque o eccDNA pode mudar por estágio)

O desenvolvimento de Drosophila envolve mudanças drásticas nos programas de transcrição e na acessibilidade da cromatina. Durante a embriogénese, ciclos celulares rápidos e stress de replicação podem facilitar a formação de eccDNA através de reparação mediada por microhomologia. Nos larvas, o crescimento e a diferenciação dos tecidos podem alterar a regulação dos transposões, potencialmente adicionando ou removendo fontes de eccDNA. A pupação, com uma ampla remodelação da cromatina, pode aumentar temporariamente as oportunidades de circularização. Os adultos—particularmente os adultos mais velhos—apresentam uma expressão elevada de TE e uma diminuição na eficiência de manutenção do genoma, o que se alinha com o aumento de eccDNAs derivados de TE reportados em 2022. Embora estas hipóteses ligadas a estágios estejam mecanicamente fundamentadas, ainda precisam ser testadas com catálogos a nível de junção; designs rigorosos devem documentar a estagiação, a consistência das réplicas e validações ortogonais para passar de uma lógica plausível para evidência.

Dicas práticas de validação:

• Utilize o design de primers de PCR inversa que abranja as junções previstas; verifique os amplicons por sequenciação Sanger.
• Para a confirmação de leituras longas, alvo regiões com conteúdo repetitivo ou círculos de múltiplos fragmentos suspeitos, priorizando tecidos com uma identidade de estágio clara.
• Considere apenas escadas de spike-in ao empregar enriquecimento (RCA) e note potenciais vieses de recuperação por classe de tamanho; evite usar RCA como um caminho de quantificação primário para comparações de estágio.

Caso B — Oryza sativa (arroz): dinâmicas de eccDNA sob escassez de fosfato

Os genomas das plantas são ricos em repetições, e as condições de stress frequentemente remodelam a cromatina e a atividade dos transposões, tornando o eccDNA uma janela promissora para a adaptação rápida. Embora o arroz sob escassez de fosfato seja um cenário convincente, a literatura varia consoante a espécie e o tipo de stress; critérios rigorosos de junção e validação cruzada são essenciais para evitar confusões causadas por artefatos de cobertura impulsionados por repetições.

Um ponto de referência informativo é o trabalho sobre patógenos fúngicos de plantas que insiste em evidências de junção em vez de cobertura apenas. Em Magnaporthe oryzae (o patógeno do fogo do arroz), Joubert e Krasileva documentaram um circularoma altamente diverso contendo retrotransposões LTR, genes e efetores utilizando Illumina e PacBio CCS, com uma rigorosa chamada de split-read. Veja Os DNAs circulares extracromossómicos do patógeno do arroz Magnaporthe oryzae (2022)Embora este estudo se concentre num fungo, os seus critérios de junção rigorosos e validação fazem dele um marco metodológico para projetos de stress em plantas.

Para sistemas de modelos de plantas diretamente, estudos com Arabidopsis thaliana demonstraram como o sequenciamento de longas leituras pode resolver a composição e a estrutura do eccDNA, destacando características de limite, como repetições invertidas. Veja Composição e Estrutura dos DNAs Circulares Extracromossómicos de Arabidopsis thaliana Revelados pela Sequenciação Nanopore (2023).

Arroz: dinâmicas de eccDNA sob stress nutricional (falta de fosfato)

Nos desenhos de carência de fosfato em arroz, considere os seguintes passos de deteção e validação:

• Deteção nativa: Começar com WGS ou ATAC-seq em tecidos de controlo vs. tecidos em privação de fosfato (raiz e folha), enfatizando a evidência de junção de leituras divididas. A abordagem de junção ATAC-seq centrada em mamíferos generaliza-se para plantas quando o mapeamento é consciente de repetições.
• Estratégia de validação: Utilizar PCR inverso para junções representativas e sequenciação de long-read para círculos complexos ou derivados de elementos transponíveis. Como as plantas frequentemente contêm eccDNA de múltiplos fragmentos e alto conteúdo de repetições, spans seletivos de ONT/PacBio ajudam a confirmar a arquitetura.
• Enriquecimento como complemento: Reserve o Circle-seq/RCA para validação direcionada em vez de quantificação primária, devido a potenciais preconceitos de tamanho/estrutura. As revisões que comparam métodos sugerem diferenças direcionais na recuperação por classe de tamanho e química, mas as curvas de viés quantitativo ainda estão a ser refinadas. Uma comparação mais ampla é resumida em Análise comparativa de metodologias para detetar DNA circular extracromossómico (2024).

Ao planear enriquecimentos ou controlos, a metodologia sobrepõe-se aos princípios gerais do nosso guia de série. Escolhendo Métodos de Enriquecimento de eccDNA: Digestão com Exonuclease, RCA, Captura e Controlo. Adapte spike-ins a contextos de DNA de plantas com uma escada de tamanhos de círculos sintéticos e registe a recuperação em intervalos de tamanho.

Considerações de design específicas para o stress nutricional do arroz:

• Cronograma de amostragem: Estabelecer amostras de base (controlo), depois introduzir a privação de fosfato por intervalos definidos (por exemplo, 24–72 horas, 1–2 semanas), amostrando primeiro as raízes (sensação de nutrientes mais direta) e as folhas mais tarde para respostas sistémicas.
• Replicação: Triplicados biológicos por condição e tecido; considerar replicados técnicos para a preparação da biblioteca para auditar a reprodutibilidade.
• Planeamento de profundidade: profundidade WGS suficiente para capturar leituras de junção em contextos de repetição (por exemplo, ≥30× de cobertura genómica para tecidos com alto conteúdo de repetição); ajustar a profundidade do ATAC-seq para a acessibilidade da cromatina vegetal.
• Anotação: Integrar catálogos de TE e modelos de genes para contextualizar a origem do eccDNA; rastrear sobreposições com genes de resposta ao stress e unidades repetitivas.
• Comparações de quantificação: Reportar contagens a nível de junção normalizadas pela profundidade de leitura; evitar o uso de contagens baseadas em enriquecimento para quantificação entre condições.

Figura 2. Esquema de amostragem de arroz para experimentos de privação de fosfato.

As raízes e folhas foram coletadas de plantas de controlo correspondentes (+P) e de plantas com deficiência de fosfato (−P) em momentos definidos (exemplo: 0, 3, 7, 14 dias). A chamada de junções WGS/ATAC foi realizada por tecido e momento; junções representativas foram validadas por PCR direcionada e sequenciação seletiva de longas leituras para confirmar a estrutura em regiões ricas em repetições.

As sobreposições de Venn ajudam a visualizar círculos específicos de condições.

Para comunicar os efeitos das condições, uma simples sobreposição das chamadas de eccDNA entre tecidos de controlo e em privação de fosfato é eficaz. Assegure-se de que a comparação é feita ao nível das junções com filtros e profundidade consistentes entre as amostras, e inclua a concordância entre réplicas.

Figura 3. Sobreposição a nível de junção das chamadas de eccDNA entre amostras de arroz controlo e em jejum de fosfato.

O diagrama de Venn mostra conjuntos de junções filtradas (exemplo de critério: ≥2 suportes de leitura dividida, MAPQ≥30) para raízes sob condições +P e -P; junções partilhadas e únicas de cada condição foram validadas para um subconjunto por PCR direcionada e confirmação por Sanger ou leitura longa.

Diferenças computacionais em genomas não humanos

Lidar com repetições e idiossincrasias da montagem do genoma é central para a análise de eccDNA em plantas. Mesmo quando a ploidia é simples (o arroz é diploide), a abundância de repetições e o mapeamento múltiplo podem inflacionar falsos positivos se os limiares de junção forem frouxos.

• Chamada de prioridade para junções: Favorizar pipelines que enfatizam leituras divididas e pares discordantes e despriorizar bandeiras apenas de cobertura; esta abordagem reflete os critérios rigorosos do estudo de Magnaporthe e mitiga os confundidores de repetição.
• Opções de ferramentas: O campo mantém várias pipelines com capacidades sobrepostas. O ECCsplorer, publicado na BMC Bioinformatics (2022), implementa opções de deteção e filtragem de leituras divididas/desacordadas; veja ECCsplorer: um pipeline para detectar eccDNA (2022). ecc_finder, publicado na Frontiers in Plant Science (2021), enfatiza a identificação robusta de split-read; veja ecc_finder: Uma Ferramenta Robusta e Precisa (2021)A plataforma integrada eccDNA-pipe (Briefings in Bioinformatics, 2024) suporta análises através de entradas e inclui módulos de distribuição de comprimento e anotação; veja eccDNA-pipe (2024).
• Ajuste de parâmetros: Nas plantas, aperte os parâmetros de mapeamento (por exemplo, predefinições do BWA-MEM ou minimap2) para minimizar leituras divididas espúrias; exija ≥2 suportes de junção; mascare repetições problemáticas conhecidas se estas produzirem junções artefatuais em conjuntos de dados simulados; e audite explicitamente o comportamento de múltipla mapeação.
• Leitura longa integração: Onde repetições obscurecem sinais de leituras curtas, adicione ONT/PacBio para leituras que abrangem junções e repetições internas. As análises de leituras longas de Arabidopsis sublinham como as características de limite e a estrutura de repetições internas se tornam interpretáveis apenas com comprimentos de leitura adequados.
• Adequação de referência: Acompanhar a versão da montagem de trilhos e lançamentos de correções. Para análises diferenciais (controlo vs. stress), manter referências e conjuntos de parâmetros idênticos; registar fluxos de trabalho em contêineres e pins de versão para reprodutibilidade.

Modelos práticos de parâmetros de alinhadores (exemplo)

• BWA‑MEM (v0.7.17+): bwa mem -t 16 -M -T 30 -c 10000 -H referencia.fa R1.fastq R2.fastq
  • Filtro pós: samtools view -q 30 para exigir MAPQ≥30 e samtools sort/index.
• minimap2 (v2.24+; leituras curtas): minimap2 -ax sr --eqx -t 16 referencia.fa R1.fastq R2.fastq
  • Para leituras longas ONT/PacBio: minimap2 -x map-ont -t 16 reference.fa longreads.fq

Porque estes funcionam: o filtro -T/MAPQ e o limite -c reduzem alinhamentos de baixa confiança e secundários que criam sinais divididos/discordantes de forma espúria em repetições; --eqx preserva os detalhes cigar/MD para a chamada de junções; exigir ≥2 suportes de leitura dividida independentes e suprimir heurísticas de resgate de pares reduz os falsos positivos. Registe as versões das ferramentas e os comandos completos nas notas do método para melhorar a reprodutibilidade e reutilização.

Como passo de reprodutibilidade, realizámos um pequeno benchmark de parâmetros em tipos de amostras representativas (adultos de Drosophila em pool; tecido radicular de arroz) para comparar os limiares de MAPQ (20 / 30 / 40) e o suporte de leituras divididas (1 / 2 / 3). Métricas de avaliação: sensibilidade (recall de junções) e taxa de falsos positivos (junções sem suporte ortogonal). Resumo de exemplo: um MAPQ mais rigoroso e a exigência de ≥2 leituras divididas reduziram as chamadas de candidatos enquanto melhoraram a especificidade; uma regra de MAPQ≈30 + ≥2 leituras divididas muitas vezes equilibra a sensibilidade e o controlo de falsos positivos. Conjuntos de dados de benchmark e um pipeline containerizado serão lançados no Zenodo/OSF (em breve).

Para escolhas de fluxo de trabalho em bioinformática e detalhes sobre filtragem de artefatos, consulte Bioinformática para eccDNA: Algoritmos de Detecção, Filtragem de Artefatos e Normas de Relato. Se precisar de um parceiro consultivo para ajudar a ajustar pipelines para genomas de plantas ou estágios de Drosófila, a visão geral de alto nível em Serviços de Bioinformática é um ponto de entrada prático.

Tabela de comparação compacta e escolhas de cenários

Escolhas de cenários (quem deve escolher o quê):

• Se o seu objetivo é a quantificação resolvida por estágios com o mínimo de trabalho de laboratório, comece com a deteção nativa de ATAC-seq/WGS (leituras divididas/pares discordantes) e valide os junctions através de PCR inverso; adicione Circle-seq para sensibilidade onde as entradas permitirem.
• Se precisar de insights sobre a adaptação ao stress das plantas em genomas ricos em repetições, combine a deteção nativa com validação Circle-seq direcionada e sequenciação de longas leituras para resolução estrutural.
• Se as suas entradas forem baixas ou preciosas, prefira a deteção nativa e aumente os replicados, uma vez que a RCA pode distorcer as distribuições de tamanho e complicar a quantificação.

Lista de verificação prática de QC e relatórios (para ambos os casos)

• Amostragem de documentos (Drosófila) ou cronogramas/tecidos de stress (arroz) com contagens de réplicas.
• Registe métricas da biblioteca (tamanho da inserção, profundidade de leitura), parâmetros de mapeamento e versões de software; containerize fluxos de trabalho.
• Forneça listas de junções (BED/VCF/CSV), distribuições de tamanhos, sobreposições de anotações (genes/TEs) e resultados de validação (PCR inverso/FISH/extensões de leitura longa).
• Inclua recuperações de escada spike-in (se estiver a utilizar enriquecimento); reporte a concordância entre réplicas (por exemplo, R²) e notas de normalização entre condições.
• Link para os dados FASTQ brutos e entregáveis processados com um dicionário de dados; manter os princípios FAIR para reutilização.

Para limites de QC e normas de reprodutibilidade adaptadas a projetos de eccDNA, consulte Métricas de Qualidade para Sequenciação de eccDNA: Eficiência de Enriquecimento, Fundo e Reprodutibilidade.

Nota de versão e âmbito do método

As pipelines e as químicas de sequenciação evoluem rapidamente. Antes de executar um grande inquérito, confirme as versões atuais e os parâmetros padrão para o ECCsplorer, ecc_finder e eccDNA-pipe; revise as versões de montagem para o seu organismo modelo; e pré-registe os limites de QC e as frações de validação por classe de tamanho. Isso ajudará a alinhar as expectativas entre o laboratório molhado, a bioinformática e os revisores pares.

Referências:

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