Introdução aos Marcadores Moleculares de DNA

Os marcadores moleculares representam uma categoria específica dentro da classificação mais ampla dos marcadores genéticos. Num contexto geral, os marcadores genéticos abrangem características que permitem o rastreamento da herança de várias características genéticas presentes num cromossoma, num segmento cromossómico específico ou numa localização gênica específica dentro de uma linhagem familiar. Os marcadores genéticos são caracterizados por duas características fundamentais: herdabilidade e a capacidade de serem distinguidos. Essencialmente, qualquer mutação genética que leve a diferenças discerníveis no fenótipo dentro de um organismo particular pode desempenhar o papel de um marcador genético. Isto torna os marcadores genéticos uma ferramenta vital na pesquisa e análise genética.

O que são Marcadores Moleculares

Os marcadores genéticos, que originam-se de variações nas sequências de nucleotídeos entre indivíduos, oferecem uma representação direta do polimorfismo genético ao nível do DNA. Eles servem como um meio direto para obter informações sobre as distinções dentro do DNA genómico de vários indivíduos biológicos ou populações. Este conceito fundamental sublinha a sua importância na pesquisa e análise genética.

Vantagens dos Marcadores Moleculares

1. Eles são apresentados na forma de ADN e não estão limitados por fatores como tecido, estágio de desenvolvimento, estação ou ambiente. Não sofrem de problemas relacionados com a expressão ou a sua falta, exibindo estabilidade.
2. Eles são numerosos, distribuídos por todo o genoma.
3. Eles exibem um alto polimorfismo, com muitas variações alélicas existentes na natureza.
4. Muitos marcadores apresentam uma natureza co-dominante, permitindo a diferenciação entre genótipos homozigóticos e heterozigóticos, tornando-os convenientes para a seleção de características agronómicas recessivas.
5. Têm um efeito neutro, não influenciando a expressão das características-alvo e não estando ligados a características indesejáveis.
6. Os seus métodos de deteção são simples e rápidos.

Comparação de Marcadores Co-Dominantes e Dominantes

Dois termos importantes no contexto de marcadores moleculares são marcadores dominantes e marcadores co-dominantes. Em termos simples, os marcadores moleculares que podem distinguir entre genótipos heterozigóticos são considerados marcadores co-dominantes.

Aplicações de Tecnologias de Marcadores Moleculares

Construção de Mapas de Ligação GenéticaOs marcadores moleculares são instrumentais na construção de mapas de ligação genética, que fornecem informações valiosas sobre a localização e a ordem dos genes nos cromossomas.

Mapeamento de Genes/QTL: Estes marcadores desempenham um papel crucial na localização de genes e Locais de Características Quantitativas (QTLs), ajudando na identificação de fatores genéticos responsáveis por características específicas.

Melhoramento Assistido por Marcadores Moleculares: Os marcadores moleculares ajudam no melhoramento seletivo ao permitir a transferência direcionada de características desejadas de um organismo para outro, aumentando a eficiência dos programas de melhoramento.

Análise da Diversidade Genética das Plantas: Marcadores moleculares são utilizados para avaliar e caracterizar a diversidade genética dentro das populações de plantas, ajudando na conservação e utilização dos recursos genéticos.

Avaliação da Variedade e Qualidade da Pureza: São utilizados para identificar e determinar a pureza genética e a identidade varietal dos materiais vegetais, garantindo a integridade das variedades de culturas.

Deteção de Doenças: Marcadores moleculares são utilizados na deteção de marcadores genéticos associados a doenças, facilitando o diagnóstico e a gestão de doenças tanto em plantas como em animais.

Tipos de Marcadores Moleculares

Primeira Geração - RFLP (Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição)

A aplicação de marcadores RFLP de primeira geração diminuiu ao longo do tempo. RFLP, que significa Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição, envolve a deteção de variações em fragmentos de DNA resultantes de alterações como substituições de bases, inserções, deleções ou duplicações que afetam os locais de reconhecimento das endonucleases de restrição no genoma da planta.

O princípio do RFLP envolve a digestão do DNA genómico de diferentes indivíduos utilizando endonucleases de restrição, o que produz fragmentos de DNA de tamanhos variados. Estes fragmentos são separados através de eletroforese e transferidos para uma membrana de hibridação. Um fragmento de DNA específico, marcado com isótopos ou não-isótopos, serve como sonda. A sonda hibridiza com os fragmentos digeridos pela enzima, revelando diferenças de comprimento entre fragmentos com sequências homólogas à sonda.

Procedimento de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) (Sidharth Mishra et al,. Avanços em Ciências Veterinárias 2019)

RFLP (Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição) reflete diferenças nos comprimentos dos fragmentos de DNA gerados após a digestão com endonucleases de restrição, revelando assim a distribuição de diferentes locais de reconhecimento de enzimas ao nível molecular do DNA.

As vantagens dos marcadores RFLP incluem a sua natureza predominantemente co-dominante e a sua alta reprodutibilidade e estabilidade.

No entanto, os marcadores RFLP têm várias desvantagens, incluindo procedimentos experimentais complexos, períodos de deteção prolongados, altos custos e adequação limitada para a criação molecular em larga escala. Além disso, o uso de isótopos radioativos na deteção pode levar à contaminação. Os métodos de rotulagem não radioativa tendem a ser mais caros, resultando em sinais de hibridação mais fracos e sensibilidade reduzida.

Tecnologias de Marcadores Moleculares Baseadas em PCR

As tecnologias de marcadores moleculares baseadas em PCR de segunda geração são atualmente as mais amplamente utilizadas em genética molecular. Os marcadores polimórficos detectados através de PCR, que abrangem tanto a PCR direta como a PCR combinada com abordagens de digestão enzimática, pertencem à categoria de marcadores de PCR. Estes marcadores incluem RAPD, SSR, STS, CAPS e dCAPS, entre outros.

RAPD, Polimorfismo de DNA Amplificado Aleatório, envolve o uso de primers curtos e aleatórios que normalmente abrangem 8-10 pares de bases para amplificar DNA genómico através da PCR. Quando a distância entre os locais de ligação de dois primers complementares reversos satisfaz as condições para a amplificação por PCR, é gerado um produto de amplificação. Quaisquer inserções, deleções ou mutações que ocorram entre os locais de ligação dos primers ou nos locais de ligação resultam na presença ou ausência de bandas no padrão eletroforético dos produtos de PCR, dando origem a marcadores RAPD.

Ilustração esquemática da análise de polimorfismo de comprimento amplificado aleatório. (Satyanarayan Panigrahi et al., Diversidade Microbiana na Era Genómica 2019)

Vantagens dos Marcadores RAPD:
Um método simples com deteção rápida.
É necessária uma quantidade mínima de DNA, e existem requisitos de qualidade de DNA flexíveis.
O mesmo conjunto de primers pode ser aplicado para análise genómica em diversos organismos, facilitando o exame de genomas completos.

Limitações dos Marcadores RAPD:
São marcadores dominantes e não conseguem distinguir entre genótipos homozigóticos dominantes e heterozigóticos, levando a dados incompletos.
A utilização de primers curtos em marcadores RAPD torna o processo de PCR suscetível a variáveis experimentais, resultando na presença de múltiplas bandas e na diminuição da consistência dos resultados.

Marcadores SSROs marcadores de Repetições em Sequência Simples, também conhecidos como DNA microsatélite ou repetições em tandem curtas (STRs), representam uma classe de sequências de DNA compostas por uma unidade repetitiva de vários (1-6) nucleotídeos. Os motivos de repetição comuns incluem (TG)n, (GA)n, (AAT)n ou (GACA)n, sendo (AT)n o mais prevalente nos genomas vegetais. Estas sequências centrais estão amplamente distribuídas em genomas eucarióticos e em alguns genomas procarióticos, encontrando-se aleatoriamente no DNA nuclear, no DNA do cloroplasto e no DNA mitocondrial. Os SSRs têm tipicamente comprimentos de 100 pares de bases ou menos.

O princípio por trás dos SSRs reside na alta conservação de sequências de cópia única em ambos os lados do DNA microsatélite. Assim, os primers podem ser desenhados com base nessas sequências flanqueadoras para a amplificação por PCR, e o tamanho dos produtos de PCR pode ser determinado através da eletroforese. O alto polimorfismo dos marcadores SSR resulta principalmente de variações no número de repetições em tandem dentro da sequência central.

Princípio do marcador SSR. (Ksenija Taski-Ajdukovic) Sinalizador de Pesquisa 2015)

Vantagens dos Marcadores SSR:
Representar marcadores co-dominantes, permitindo a diferenciação entre heterozigotos e homozigotos.
Requerem pequenas quantidades de amostras de DNA e não são excessivamente exigentes em termos de qualidade do DNA.
Apresentar boa repetibilidade e alta fiabilidade.
Apresentam um elevado grau de diversidade alélica, resultando em polimorfismo significativo.

Limitações dos Marcadores SSR:
O conhecimento da sequência de ADN em ambas as extremidades do motivo de repetição é essencial. Nos casos em que esta informação não está acessível em bases de dados de ADN, o sequenciamento e o design de primers tornam-se necessários, resultando em custos de desenvolvimento aumentados.

Marcadores AFLP, ou Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Amplificados, refere-se a marcadores polimórficos criados através da amplificação de fragmentos de DNA digeridos por enzimas de restrição. As diferenças surgem devido a mutações de nucleotídeos únicos, inserções, deleções e outras mutações que levam a alterações nos locais de reconhecimento das enzimas de restrição. Essas diferenças podem ser detectadas através da amplificação seletiva por PCR. O AFLP é uma evolução do RFLP, com a distinção a residir no método de deteção. O AFLP revela polimorfismos nos locais das enzimas de restrição e variações de bases seletivas subsequentes.

O princípio por trás do AFLP está enraizado tanto na digestão com enzimas de restrição quanto na tecnologia de PCR. O DNA genómico é primeiro digerido com duas enzimas de restrição, resultando em fragmentos de DNA de tamanhos variados. Adaptadores artificiais são então ligados às extremidades desses fragmentos de restrição, servindo como modelos para a reação de amplificação. A pré-amplificação é realizada usando a cadeia complementar do adaptador artificial como primer. Subsequentemente, 1-3 bases seletivas são adicionadas aos produtos pré-amplificados como primers para amplificação seletiva. A eletroforese em gel de poliacrilamida é utilizada para separação, e os polimorfismos são detectados com base nas diferenças nos comprimentos dos fragmentos amplificados.

Polimorfismo de comprimento de fragmento amplificado (G. Dorado, Módulo de Referência em Ciências Biomédicas, 2017)

Vantagens dos Marcadores AFLP:
Combina a fiabilidade da tecnologia RFLP e a eficiência da tecnologia PCR, permitindo a deteção de um grande número de fragmentos digeridos por enzimas de restrição numa única reação. Produz informação sobre 50 a 100 bandas espectrais numa única corrida.
Oferece marcadores dominantes (presença ou ausência de bandas) e co-dominantes (diferenças de comprimento devido a inserções ou deleções).
Não requer o custo de desenvolvimento de marcadores rotulados, mas necessita da otimização de primers específicos e combinações de primers.
Não requer informações de sequência de ADN genómico.
Requer apenas uma quantidade mínima de DNA.

Desvantagens dos Marcadores AFLP:
Altos requisitos de qualidade da amostra de ADN.
Frequentemente utiliza coloração em prata, que pode ser relativamente demorada e dispendiosa.
Os marcadores AFLP não estão distribuídos uniformemente pelos cromossomas e tendem a agrupar-se em regiões próximas aos centrómeros.

Marcadores SNP

SNP, que significa Polimorfismo de Nucleotídeo Únicoé um marcador de terceira geração que diz respeito à diversidade de nucleotídeos a nível genómico. Surge de variações em um único nucleótido, como transições, transversões, inserções, deleções, entre outros, dentro de uma sequência de ADN.

Os SNPs podem ser detetados e analisados utilizando várias técnicas. Quando uma sequência de DNA conhecida está disponível, pode ser comparada a bases de dados de sequências de DNA, incluindo genomas de referência ou genomas de espécies estreitamente relacionadas, para identificar SNPs existentes. Além disso, se os SNPs estiverem localizados em determinados locais de reconhecimento de enzimas de restrição, podem ser desenhados primers com base nas sequências que flanqueiam o SNP para amplificação por PCR. Os produtos de PCR podem ser digeridos com enzimas de restrição e sujeitos a eletroforese para os transformar em marcadores CAPS co-dominantes. Alternativamente, podem ser desenhados primers para colocar o SNP na extremidade 3', e a presença ou ausência de bandas amplificadas é utilizada para convertê-los em marcadores PCR dominantes. Métodos mais diretos incluem sequenciação de DNA ou utilização de técnicas de hibridização em chip de DNA para deteção.

Um fluxo de trabalho esquemático descrevendo o desenvolvimento e a avaliação de marcadores SNP.

Marcadores SNP:

Vantagens:
Abundantes em número e amplamente distribuídos nos genomas.
Alta estabilidade.
Natureza co-dominante.
Adequado para triagem rápida e em grande escala.

Desvantagens:
Alto custo ao utilizar métodos de sequenciação ou hibridação de chip de DNA.

Comparação de Vários Marcadores Moleculares de DNA