Expandindo Horizontes: Aplicações Diversas do DAP-Seq

A regulação genética representa a pedra angular da complexidade biológica, governando a precisão espaciotemporal da diferenciação celular, do padrão de desenvolvimento e da adaptação ambiental. Compreender como os fatores de transcrição (TFs) se ligam ao DNA e regulam genes-alvo é fundamental para desvendar a complexidade das redes genéticas. Neste contexto, a sequenciação por purificação de afinidade ao DNA (DAP-Seq), com as suas características de alto rendimento e independência de anticorpos, tornou-se uma ferramenta revolucionária para a resolução em todo o genoma das interações proteína-DNA. O DAP-Seq identifica com precisão os locais de ligação de fatores de transcrição (TFBSs) através da expressão in vitro de TFs e da ligação a bibliotecas de DNA genómico em combinação com tecnologia de sequenciação de alto rendimento. O DAP-Seq oferece oportunidades sem precedentes para estudos genómicos em espécies modelo e não modelo.

Decodificação DAP-Seq da Adaptação das Plantas ao Ambiente

As plantas sentem e respondem a mudanças ambientais através de mecanismos moleculares, e os fatores de transcrição são os reguladores centrais deste processo. O DAP-Seq é particularmente vantajoso para estudos de interações planta-ambiente, especialmente em espécies não-modelo.

Um estudo da eficiência do uso de nitrogénio (NUE) no arrozOs cientistas utilizaram a tecnologia DAP-Seq para descobrir que o fator de transcrição OsGATA8 equilibra a absorção de nitrogênio e a formação de perfilhos ao reprimir a expressão do gene da proteína transportadora de amônio OsAMT3.2 e do repressor de perfilhos OsTCP19, otimizando assim o rendimento das culturas.

OsPHR2 regula a absorção de NO3− micorrízica através da modulação direta de OsNAR2.1 e OsRT2.1/2.2 (Wang et al., 2025)

Um estudo dos mecanismos de resistência a doenças em citrinos.A DAP-Seq combinada com a análise do transcriptoma revelou que o CsWRKY33 aumenta a resistência das frutas a doenças ao regular genes e vias de estresse oxidativo. Esses estudos não apenas aprofundam a compreensão da adaptação das plantas à adversidade, mas também fornecem alvos para o melhoramento molecular por design. Projetos experimentais inovadores, como comparações entre espécies (por exemplo, trigo vs. Arabidopsis thaliana) ou análises dinâmicas em múltiplos pontos no tempo, expandem ainda mais as dimensões da aplicação do DAP-Seq em estudos de adaptação ecológica.

Análise do transcriptoma de genes dependentes de TIP4;3 (Zeng et al., 2024)

Aplicações do DAP-Seq na Investigação Epigenética

Epigenético os estudos concentram-se nos mecanismos regulatórios dinâmicos do estado da cromatina e da expressão génica em condições de sequência de DNA inalterada. Ao projetar experimentos in vitro, o DAP-Seq é capaz de capturar diretamente informações sobre as interações entre fatores de transcrição e DNA, refletindo assim indiretamente os efeitos das modificações epigenéticas na atividade génica. Em plantas, por exemplo, a acessibilidade da cromatina está geralmente intimamente ligada à ligação de fatores de transcrição específicos. O DAP-Seq não só identifica regiões de cromatina aberta, mas também revela os efeitos regulatórios das marcas epigenéticas (por exemplo, modificações de histonas) na recrutamento de fatores de transcrição, analisando a distribuição dos locais de ligação. Comparado com métodos tradicionais ChIP-SeqO DAP-Seq não requer anticorpos, evitando assim o problema de falsos negativos devido à especificidade insuficiente dos anticorpos, ao mesmo tempo que atinge uma resolução de base única.

Um estudo sobre a tolerância ao calor na maçã.: O DAP-Seq identificou com sucesso a região do promotor do gene do fator de choque térmico ligado ao fator de transcrição MdWRKY75 sob stress térmico, revelando a ligação molecular entre a regulação epigenética e a tolerância basal ao calor. Além disso, os dados do DAP-Seq podem ser complementados por ATAC-Seq (análise da abertura da cromatina) para construir uma rede regulatória epigenética completa desde a estrutura da cromatina até a ligação de fatores de transcrição.

MdWRKY23 ativa transcricionalmente a expressão de MdCOI1 para regular a via de sinalização de JA (Han et al., 2024)

Um estudo da regulação de triterpenoides em Ganoderma lingzhiA DAP-Seq identificou o motivo de ligação do SREBP (5'-GRVGRVGRVGR-3') e 1.532 genes-alvo enriquecidos nas vias do mevalonato (MVA) e do ergosterol. A análise multi-ômica revelou que a superexpressão do SREBP regula positivamente enzimas chave (por exemplo, HMGS, MVD) e aumenta a produção de ácido ganodérico em 36,15%, enquanto a inibição farmacológica com fatostatina reverteu esses efeitos, confirmando a regulação negativa por feedback do SREBP. Notavelmente, o SREBP também ativou genes do metabolismo de glicerofosfolípidos (g1208, g4309), ligando a homeostase lipídica à síntese de metabolitos secundários. Este estudo fornece a primeira evidência do papel regulador não animal do SREBP e propõe estratégias de engenharia transcricional para otimizar os rendimentos de compostos medicinais fúngicos.

O fator de transcrição bHLH-zip SREBP regula os metabolismos de triterpenoides e lipídios no fungo medicinal Ganoderma. lingzhi (Liu et al., 2023)

Um estudo da sinalização de brassinosteroides (BR) na fibra de algodão.identificou GhBES1.4 como um regulador mestre através da perfuração DAP-Seq de 1.531 alvos diretos, incluindo genes de biossíntese de BR (GhCPD, GhCYP90D1) e motores de elongação celular (GhBRL). A validação funcional mostrou que a superexpressão de GhBES1.4 aumentou o comprimento da fibra ao ativar o metabolismo de ácidos gordos e a sinalização de etileno, enquanto o silenciamento prejudicou a elongação. A integração com dados de RNA-seq e GWAS priorizou sete genes-chave (por exemplo, GhCYP84A1) que melhoram a expansão das células da fibra através da ligação ao motivo E-box. Tratamentos com inibidores da biossíntese de BR (BRZ) confirmaram ainda mais a dependência regulatória BR-GhBES1.4. Este trabalho estabelece uma rede transcricional hierárquica e destaca GhBES1.4 como um alvo principal para melhoramento molecular visando melhorar a qualidade da fibra de algodão e a sustentabilidade agrícola.

Identificação de genes-alvo diretos de GhBES1.4 usando DAP-seq (Liu et al., 2023)

Inovações em Biologia Sintética Impulsionadas por DAP-Seq

A biologia sintética visa modificar sistemas biológicos através do design de engenharia, e elementos regulatórios de genes precisos estão no cerne da construção de vias artificiais ou biossensores. O DAP-Seq fornece suporte de dados para o design racional de componentes de biologia sintética, ao fornecer mapas de ligação em todo o genoma de fatores de transcrição naturais. Por exemplo, na construção de fábricas celulares microbianas, os investigadores utilizaram dados de DAP-Seq para otimizar sequências de promotores e aumentar a eficiência de expressão de genes exógenos. Na biologia sintética de plantas, o DAP-Seq foi utilizado para desenhar fatores de transcrição artificiais para a regulação direcionada da biossíntese de metabolitos secundários, como os alcaloides medicinais. Num caso inovador, um sistema ativado por CRISPR orientado por DAP-Seq aumentou com sucesso o rendimento de tanshinonas em Salvia divinorum. Além disso, o DAP-Seq ajudou a avaliar a estabilidade de circuitos genéticos sintéticos e reduziu a carga metabólica de estirpes engenheiradas ao prever a ligação fora do alvo de fatores de transcrição ao DNA não alvo.

Esquema das estratégias de engenharia baseadas em fatores de transcrição em microalgas, juntamente com abordagens prospectivas (Gupta et al., 2024)

A função dual do DAP como precursor de moléculas de armazenamento e regulador do equilíbrio redox, que é essencial para manter a homeostase celular em condições de stress. Através da sobreexpressão direcionada de enzimas que metabolizam DAP, como a glicerol-3-fosfato desidrogenase, as estirpes de algas engenheiradas demonstraram uma tolerância melhorada a fatores de stress ambiental, como alta salinidade e limitação de nutrientes. Esta resiliência traduz-se diretamente em sistemas de cultivo escaláveis, reduzindo a dependência de recursos hídricos e meios de crescimento dispendiosos. Além disso, o estudo sublinha o papel do DAP na sincronização da fixação de carbono com a biossíntese a montante, permitindo um controlo dinâmico sobre as vias metabólicas através de circuitos genéticos responsivos à luz.

Desafios e Futuro do DAP-Seq

Embora o DAP-Seq ofereça uma identificação de alta capacidade de ligação de fatores de transcrição (TFBSs), a sua in vitro o quadro apresenta lacunas críticas: (1) incapacidade de replicar a dinâmica da cromatina (por exemplo, ligação de fatores de transcrição dependente de metilação de DNA/modificação de histonas), (2) cegueira para interações de heterodímeros e (3) ruído proveniente de fatores de transcrição de baixa abundância ou sequências repetitivas. Para superar estas limitações, adaptações de próxima geração como o DAP-Seq com dupla marcação (dDAP-Seq) agora decifram a co-ligação de heterodímeros em todo o genoma, enquanto a transcriptómica espacial de célula única mapeia a atividade espacial e temporal de fatores de transcrição em contextos como o carcinoma hepatocelular (por exemplo, dinâmicas do oncogene MYC). Ferramentas de previsão de motivos impulsionadas por IA refinam ainda mais o design experimental, aumentando a eficiência em aplicações como a engenharia da via de biossíntese de tanshinona.

Os avanços futuros priorizam bibliotecas de DNA epigeneticamente preservadas (por exemplo, a dissecção da absorção de nitrogénio mediada por OsNLP3 sob stress em arroz), fusão de dados cross-ómicos (por exemplo, o controlo metabólico dual de HNF4α no cancro do fígado através da interacção entre glicólise/OXPHOS) e integração do genoma em 3D para processos dinâmicos como a organogénese. Ao fundir a relevância fisiológica com resolução em múltiplas escalas, o DAP-Seq está a evoluir para um conjunto de ferramentas único e interdisciplinar, abordando tanto a adaptação das plantas ao stress como os mecanismos do cancro, enquanto contorna as limitações tradicionais do ChIP-Seq. Esta reinvenção impulsionada pela inovação posiciona o DAP-Seq como um destaque nas pesquisas de regulação transcricional de precisão.

Conclusão

Desde o seu lançamento em 2016, o DAP-Seq tornou-se uma ferramenta chave para a investigação genómica. Em plantas, revelou os mecanismos moleculares pelos quais o citrino CsWRKY33 aumenta a resistência a doenças através da via de stress oxidativo e o arroz OsGATA8 coordena o uso de azoto e a formação de perfilhos. Em epigenética, a tecnologia combinada com ATAC-Seq construiu um modelo de associação da abertura da cromatina e da ligação de fatores de transcrição.

A contínua inovação da tecnologia DAP-Seq trará a genómica para a era da resolução multidimensional. A combinação da genómica espácio-temporal de células únicas e modelos preditivos impulsionados por inteligência artificial deverá proporcionar avanços mecanicistas em problemas biológicos complexos, como a diferenciação de células estaminais ou a evolução adaptativa ecológica. Embora a relevância fisiológica dos experimentos in vitro ainda precise ser compensada por modelos de organoides ou validação in situ, a integração de abordagens interdisciplinares (por exemplo, biologia sintética e biologia de sistemas) tornará esses métodos mais aplicáveis. Como demonstrado pelo avanço do dDAP-seq na pesquisa de dímeros, o profundo acoplamento da inovação tecnológica e dos problemas biológicos certamente levará a descobertas mais inovadoras nas ciências da vida.

Referências:

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