A Visão Completa do Sequenciamento de Longas Leituras em 2024

Histórico da Sequenciação de Longas Leituras

tecnologias de sequenciação de leitura longa. A sequenciação de leitura curta é caracterizada pela produção de fragmentos de DNA sequenciados que têm um comprimento relativamente curto, enquanto a sequenciação de leitura longa permite a leitura de sequências mais longas, o que pode facilitar a montagem de genomas e a análise de regiões complexas do DNA. Estas inovações têm impulsionado avanços significativos em várias áreas da biologia, medicina e genética. sequenciação de leitura longaComparado com o sequenciamento de leituras curtas, o sequenciamento de leituras longas pode gerar diretamente sequências > 10 kb a partir de DNA nativo, e pode resolver de forma fiável sequências repetidas e grandes rearranjos genómicos, permitindo uma deteção mais precisa e completa de moléculas de ácidos nucleicos, identificando variantes estruturais e mais transcritos no genoma. Agora, as abordagens de sequenciamento de leituras longas são representadas por Pacific Biosciences e Oxford Nanopore tecnologias, e devido à sua alta capacidade de processamento, leituras longas e à capacidade de detectar diretamente modificações de metilação de bases, está a ser cada vez mais aplicada nos campos da montagem de genomas, marcadores epigenéticos, transcriptómica e metagenómica.

Visão geral do sequenciamento de long-read

Quais são os métodos de sequenciação de leitura longa?

Sequenciação de leitura longa(LRS), também conhecido como sequenciação de terceira geração, não requer fragmentação do DNA para sequenciação, permitindo assim abranger sequências repetitivas inteiras e alcançar uma montagem contínua e completa. Com a melhoria da capacidade e precisão da sequenciação, a tecnologia LRS pode determinar sequências contínuas de dezenas de milhares a vários megabases, e a maturidade tecnológica está a aumentar de forma constante.

Os principais métodos de sequenciação de long-read atualmente são:

Sequenciação por NanoporosPioneirado pela Oxford Nanopore Technologies (ONT), o sequenciamento por nanopore envolve a passagem de moléculas de DNA de cadeia simples através de um nanopore proteico embutido numa membrana sintética. À medida que o DNA atravessa o nanopore, ele modula a corrente iónica, permitindo a deteção em tempo real de sequências de nucleotídeos. O sequenciamento por nanopore oferece portabilidade, tempos de resposta rápidos e a capacidade de gerar leituras ultra-longas, tornando-o adequado para uma ampla gama de aplicações, incluindo diagnósticos clínicos, vigilância de doenças infeciosas e estudos de metagenómica.

Um diagrama esquemático do mecanismo de sequenciação das Tecnologias Oxford Nanopore (Figura criada com o uso do BioRender.com)

Sequenciação em Tempo Real de Molécula Única (SMRT)Desenvolvido pela Pacific Biosciences (PacBio), o sequenciamento SMRT utiliza uma abordagem única de sequenciamento por síntese. Envolve a imobilização de moléculas individuais de DNA polimerase numa superfície sólida dentro de nanostruturas de guia de onda de modo zero (ZMW). Cada ZMW contém um pequeno poço onde ocorre o sequenciamento. Durante o sequenciamento, nucleotídeos marcados com fluorescência são adicionados ao molde de DNA ligado à polimerase, e os sinais de luz emitidos são detetados em tempo real. Este método produz leituras longas com alta precisão e é particularmente útil para resolver regiões genómicas complexas, como sequências repetitivas e variações estruturais.

Princípio da sequenciação em tempo real de molécula única (SMRT) da PacBio (Goodwin, McPherson e McCombie, 2016)

Sequenciação de leitura longa VS sequenciação de leitura curta

Como é que eles funcionam?

Sequenciação de leitura longa e a sequenciação de leituras curtas têm princípios de funcionamento diferentes com base no comprimento dos fragmentos de ADN.

A sequenciação de leitura longa funciona nos seguintes passos: primeiro, os fragmentos de DNA são quebrados em fragmentos maiores que variam de milhares a dezenas de milhares de pares de bases de comprimento, e adaptadores de sequenciação são anexados às extremidades dos fragmentos de DNA. A biblioteca de DNA preparada é carregada na plataforma de sequenciação de leitura longa. Sequenciação SMRTas moléculas de DNA polimerase estão imobilizadas numa superfície sólida dentro de uma nanostrutura de guia de onda em modo zero (ZMW), permitindo que moléculas individuais de DNA se liguem à DNA polimerase dentro do ZMW. Nucleotídeos marcados com fluorescência são então adicionados ao molde de DNA e o sinal de luz emitido é detetado em tempo real. Os sinais fluorescentes são convertidos em sequências de nucleotídeos ao observar o seu tempo e intensidade. Em Sequenciação por nanoporoAs moléculas de DNA estão embutidas em minúsculos nanoporos de proteína numa membrana sintética. À medida que o DNA passa pelo nanoporo, provoca distúrbios característicos nas correntes iónicas que fluem através do poro. Estes distúrbios são detetados e registados como sinais elétricos, que são então convertidos em sequências de nucleotídeos utilizando algoritmos especializados. Estas sequências são depois alinhadas a um genoma de referência ou sujeitas a montagem de novo para identificar variantes genéticas, rearranjos estruturais e outras características genómicas.

O trabalho de sequenciação de leituras curtas passo a passo é o seguinte: primeiro, os fragmentos de DNA alvo são quebrados em fragmentos menores e, em seguida, adaptadores de sequenciação são anexados às extremidades dos fragmentos de DNA. Os fragmentos de DNA processados são fixados a superfícies sólidas, como lâminas de vidro ou células de fluxo, através de conectores. Os fragmentos de DNA são amplificados em clusters idênticos por amplificação em ponte ou geração de clusters. Cada cluster representa um fragmento de DNA da amostra original, e as sequências de DNA em cada cluster são lidas simultaneamente utilizando uma plataforma de sequenciação. A sequenciação Illumina é uma das plataformas de sequenciação de leituras curtas mais utilizadas, que utiliza uma abordagem de terminador reversível. Nucleotídeos marcados fluorescentemente são adicionados a clusters de fragmentos de DNA. À medida que cada nucleotídeo é incorporado à cadeia de DNA em crescimento, a sua marcação fluorescente é capturada e registada, a marcação fluorescente é removida após o registo e o próximo nucleotídeo é adicionado. Múltiplos ciclos são realizados para gerar leituras de sequências de DNA. Os sinais fluorescentes ou sequências de nucleotídeos são então processados e convertidos para um formato digital. As leituras de sequência curtas são então comparadas a um genoma de referência ou reassembladas.

Quais são as vantagens e desvantagens do sequenciamento de long-read e do sequenciamento de short-read?

<ul class="ullist"> <li>alta precisão com boa profundidade de cobertura</li> <li>leituras longas que podem ajudar a resolver ambiguidades</li> <li>não é necessária amplificação de DNA</li> <li>tempo de resposta comparativamente mais rápido</li> <li>longa duração com dificuldades de faseamento</li> <li>o equipamento de sequenciação é caro</li> <li>proibitivo em termos de custo para laboratórios clínicos menores</li> <li>taxa de erro historicamente mais alta</li> </ul> <p>vantagens da sequenciação de leituras curtas</p> <p>vantagens da sequenciação de leituras longas</p> <p>desvantagens da sequenciação de leituras curtas</p> <p>desvantagens da sequenciação de leituras longas</p>

A vantagem do sequenciamento de long-read da CD Genomics

O Fluxo de Trabalho da Sequenciação de Longas Leituras da CD Genomics

Conclusão

Sequenciação de leitura longa ajuda a traçar mapas do genoma e do transcriptoma, permitindo a deteção de ADN, a deteção de grandes variações estruturais e a deteção de metilação, desempenhando um papel indispensável na investigação genómica. A utilização de múltiplas plataformas de sequenciação para uma análise abrangente dos alvos é atualmente o principal método de sequenciação utilizado e tem alcançado bons resultados. No entanto, melhorar a precisão da sequenciação longa continua a ser o nosso foco. Com a melhoria contínua da precisão da tecnologia de sequenciação de leituras longas, o seu papel na investigação científica tornará-se cada vez mais importante.

Com tecnologia avançada de sequenciação de long-read e serviços profissionais, a CD Genomics está dedicada a apoiar a investigação em genómica. Abrace o futuro da genómica com a CD Genomics e embarque numa jornada de descoberta e inovação.

Referência:

1. Hu, T., N. Chitnis, D. Monos e A. Dinh (2021). "Tecnologias de sequenciação de nova geração: Uma visão geral." Hum Immunol 82(11): 801-811.