Diretrizes para Preparação de Amostras de Sequenciação de Longa Leitura

DIRECTRIZES PARA A SUBMISSÃO DE AMOSTRAS DE DNA

Linhas celulares

Colete células cultivadas em parede ou células em suspensão, remova o meio de cultura; lave com PBS 1-2 vezes rapidamente, remova o PBS por centrifugação a baixa velocidade; transfira as células para tubos EP de 1,5 ml sem enzimas, centrifugue para remover o sobrenadante e coloque em nitrogênio líquido ou no congelador a -80 °C para congelamento rápido e transporte em gelo seco.

Nota: ≥5×10⁷ são necessárias células por biblioteca. O rendimento de DNA de diferentes tipos de células varia. Em geral, o rendimento de DNA de células maiores é ligeiramente inferior, como os miofibroblastos e os neurofibroblastos, e o volume celular pode ser aumentado adequadamente.

Sangue

Amostras de sangue total fresco são recolhidas diretamente utilizando tubos de coleta de sangue anticoagulados com EDTA, misturadas 10 vezes com inversões suaves, e depois colocadas em nitrogênio líquido ou em frigorífico a -80 °C e enviadas em gelo seco após serem anticoaguladas.

Nota:

• Sangue com eritrócitos nucleados: ≥500 μl de sangue total por biblioteca.
• Eritrócitos não nucleados no sangue: ≥1,5 ml de sangue total por biblioteca.
• O rendimento de DNA varia bastante entre espécies e indivíduos, com os eritrócitos de aves ou peixes contendo núcleos e um rendimento de DNA ligeiramente superior, enquanto os eritrócitos do sangue humano e de mamíferos não têm núcleos e apresentam um rendimento de DNA mais baixo, pelo que o volume da amostra deve ser aumentado em conformidade.

Tecidos Animais

1. Tecidos frescos retirados de organismos vivos (ou dentro de 10 minutos após a morte do organismo) foram selecionados e lavados com solução salina ou PBS pré-arrefecidos o mais rapidamente possível após a amostragem para remover manchas de sangue e sujidade.
2. Os tecidos conjuntivos e adiposos e outros tipos de tecidos não necessários para o estudo foram rapidamente removidos em gelo, e as amostras foram divididas em pequenos pedaços de cerca de 30-50 mg (do tamanho de um grão de feijão verde, quanto menor o tecido, melhor o efeito de preservação).
3. Secar com papel absorvente e colocar em tubos EP de 1,5/2,0 ml sem enzimas ou tubos de centrifugação.
4. Colocar em azoto líquido ou em congelador a -80°C após o congelamento rápido e transportar em gelo seco.
5. Nota:

• Cada biblioteca requer ≥1,5 g de tecido animal.
• O rendimento de DNA varia amplamente entre diferentes tipos de tecidos, por exemplo, o rendimento de DNA é mais elevado em tecidos hepáticos metabolicamente ativos e mais baixo em tecidos musculares, o que não é recomendado.
• Amostras de sangue ou fígado são recomendadas para peixes e aves.

Amostras de Plantas

Recomenda-se o uso de amostras de tecido frescas, que devem ser lavadas com etanol a 70% ou água estéril, secas com papel absorvente, colocadas em nitrogênio líquido ou em congeladores a -80°C, e depois colocadas em tubos de centrífuga de 50 ml pré-arrefecidos ou envolvidas em papel de alumínio e colocadas em sacos autoclaváveis, sendo enviadas em gelo seco. É necessário mais de 2 g por biblioteca.

Microalgas

Algas frescas são recolhidas, transferidas para tubos EP de 1,5 ml sem enzimas, lavadas uma vez com solução de EDTA a 0,3 M ou etanol a 70%, o sobrenadante é removido, congeladas rapidamente em azoto líquido ou no congelador a -80 °C, e enviadas em gelo seco. São necessários mais de 2 g por biblioteca.

Amostras Microbianas

As bactérias, incluindo fungos, actinobactérias e bactérias, devem ser recolhidas em estágios de crescimento logarítmico, removidas do meio de cultura e de outras impurezas, transferidas para tubos EP de 1,5 ml sem enzimas, congeladas rapidamente em nitrogénio líquido ou em congelador a -80 °C, e transportadas em gelo seco. São necessários mais de 2 g por biblioteca.

DIRECTRIZES PARA A SUBMISSÃO DE AMOSTRAS DE RNA

Linhas Celulares

Colete células em suspensão ou células em parede em tubos EP/tubos de centrífuga sem enzimas e remova o sobrenadante por centrifugação a baixa velocidade. 1 × 10⁵-10^sete células mais 1 ml de reagente TRIzol, lise por repetidas sopros para evitar aglomeração, incube à temperatura ambiente durante 5-10 min para lisar completamente em homogeneizado, depois congele a -80 °C e transporte em gelo seco.

Sangue

Recomenda-se que o sangue total seja isolado e entregue utilizando Tubos de RNA Sanguíneo especializados, que contêm reagentes específicos para a fixação de RNA que protegem as moléculas de RNA da degradação por enzimas de RNA e minimizam a alteração das mudanças in vivo na expressão génica.

2. Sangue fresco é recolhido utilizando Tubos de RNA Sanguíneo contendo 2,5 ml de sangue por tubo (a, sangue nucleado eritroide: ≥2,5 ml de sangue total por biblioteca; b, sangue anucleado eritroide: ≥5 ml de sangue total por biblioteca).

3. Invertido suavemente e misturado 8-10 vezes imediatamente após a recolha.

4. Colocado na vertical à temperatura ambiente durante 2 a 72 horas e transportado em gelo seco.

5. Após 2 - 72 horas, transportar em gelo seco.

Tecidos Animais

1. Os tecidos recolhidos in vivo são lavados com solução salina livre de RNase ou PBS para remover manchas de sangue e sujidade, e as amostras são divididas em pequenos pedaços de cerca de 30-50 mg, submersos em azoto líquido para congelamento rápido, colocados em tubos EP ou tubos de centrifugação livres de enzimas após o congelamento completo, armazenados em azoto líquido ou a -80°C, e transportados em gelo seco.

2. Se a solução de lise TRIzol for utilizada para preservar as amostras enviadas, primeiro, o azoto líquido é triturado em pó, depois adiciona-se TRIzol para lise, a dosagem de referência é de 50-100 mg/ml de TRIzol, após 5 minutos de lise à temperatura ambiente, -80 °C para congelamento e gelo seco para transporte.

3. Se o RNAlater for utilizado, siga as instruções do RNAlater. Mantenha o tamanho do bloco de tecido em 5 mm, muito pequeno não é favorável à recolha da amostra, muito grande faz com que a solução protetora não consiga penetrar o tecido de forma uniforme.

Amostras de Plantas

Recomenda-se o uso de amostras de tecido frescas. Após a amostragem, o material deve ser rapidamente lavado com DEPC-H livre de RNase.₂O ou 75% de etanol para remover poeira e sujidade da superfície do material, secar com papel absorvente e dividir a amostra em pequenos pedaços de cerca de 50-100 mg, congelar rapidamente em azoto líquido, colocar em tubos EP livres de RNase ou tubos de centrifugação, cerca de 500 mg por tubo, congelar a -80 °C e transportar em gelo seco. São necessários mais de 3-4 g de tecido vegetal fresco por biblioteca.

Microalgas

Após a coleta de algas frescas, transfira para tubos EP de 1,5 ml sem enzimas e lave uma vez com uma solução de EDTA 0,3 M livre de RNAase ou etanol a 70% para remover o sobrenadante. Cada biblioteca requer ≥3 g de algas.

Amostras Microbianas

Fungos em meio sólido, selados com filme de selagem e transportados à temperatura ambiente. Para fungos cultivados em meio líquido, centrifugar os fungos em tubos de centrifugação e imediatamente congelar rapidamente em azoto líquido, armazenar a -80°C e transportar em gelo seco. São necessários aproximadamente dois volumes de placa de 90 mm/50 ml de corpos fúngicos recém-cultivados por biblioteca.