Qual é a diferença entre RNA-Seq de leituras curtas e leituras longas?

A RNA-seq é a pedra angular da análise de expressão gênica diferencial (DGE), um método fundamental na biologia molecular. O fluxo de trabalho convencional começa com a extração de RNA no laboratório, seguido pela enriquecimento de mRNA ou remoção de RNA ribossómico, síntese de cDNA e a elaboração de bibliotecas de sequenciamento ligadas a adaptadores. Estas bibliotecas são posteriormente submetidas a sequenciamento de alto rendimento, frequentemente utilizando plataformas Illumina, gerando leituras que variam de 100 a 30 milhões por amostra. A fase computacional subsequente envolve o alinhamento ou montagem das leituras em transcriptomas, quantificação de transcritos sobrepostos, normalização e filtragem entre amostras, culminando em modelagem estatística para discernir alterações significativas nos níveis de expressão de genes ou transcritos entre coortes de amostras.

Historicamente, o RNA-seq tem abraçado diversas plataformas, destacando-se a Illumina, conhecida pelos seus comprimentos de leitura curtos, em contraste com plataformas de sequenciação de leitura longa como a PacBio e a Nanopore, cada uma oferecendo vantagens e desvantagens distintas.

Os serviços de sequenciação de alto rendimento e construção de bibliotecas da CD Genomics permitem uma análise aprofundada dos transcriptomas. A CD Genomics oferece serviços de RNA-Seq de leituras curtas e longas, garantindo uma pesquisa robusta do transcriptoma em amostras da mais alta qualidade.

Sequenciação de Leitura Curta vs. Sequenciação de Leitura Longa

A sequenciação de leitura curta e a sequenciação de leitura longa são metodologias distintas na sequenciação de DNA ou RNA, cada uma oferecendo características e vantagens únicas na decodificação da informação genética.

Sequenciação de leitura curta envolve a análise de sequências de DNA ou RNA em fragmentos mais curtos. Proeminente entre as tecnologias de sequenciação de leituras curtas está a plataforma da Illumina, conhecida por gerar sequências que abrangem dezenas a centenas de pares de bases.

Vantagens: O sequenciamento de leituras curtas apresenta alta precisão, custo-efetividade e escalabilidade, tornando-o ideal para tarefas como montagem de genomas, perfilagem de expressão génica e deteção de SNPs.
Desvantagens: No entanto, a sequenciação de leituras curtas pode falhar em delinear sequências longas repetitivas ou regiões sobrepostas com precisão.

Por outro lado, sequenciação de leitura longa destaca-se na captura de fragmentos de DNA ou RNA mais longos, frequentemente abrangendo milhares a centenas de milhares de pares de bases.

Vantagem: A sua capacidade de decifrar sequências mais longas aborda os desafios colocados por estruturas genómicas complexas e variações estruturais elusivas, fornecendo insights genómicos mais abrangentes.
Desvantagens: A sequenciação de leitura longa geralmente implica custos mais elevados, taxas de erro aumentadas e maior complexidade no processamento e análise de dados.

A seleção entre sequenciação de leituras curtas e leituras longas depende das necessidades específicas do estudo. Leituras curtas são adequadas para empreendimentos de sequenciação em larga escala, deteção de SNPs e estudos de expressão génica, enquanto leituras longas destacam-se na resolução de estruturas genómicas complexas, facilitando a montagem do genoma e identificando variações estruturais dentro dos genes. Frequentemente, os investigadores optam por uma abordagem híbrida, aproveitando ambas as tecnologias para obter uma compreensão mais detalhada das paisagens genéticas.

Tabela 1 Leitura curta vs. leitura longa de RNA-seq

	cDNA-Seq de leitura curta	cDNA-Seq de leitura longa	RNA-Seq de leitura longa
Plataformas	Illumina, Ion Torrent	PacBio	Oxford Nanopore
Prós	- Muito alta capacidade de processamento: 100-1.000 vezes mais leituras por corrida do que as plataformas de leitura longa. - As curvas de viés e erro são facilmente compreendidas. - Oferece numerosos métodos compatíveis e fluxos de trabalho computacionais para a análise de RNA degradado.	- Captura muitos transcritos completos em leituras longas de 1-50 kb. - Simplifica métodos computacionais para análise de transcriptoma ab initio.	- Segmentos de leitura longa que variam entre 1-50 kb capturam eficazmente transcrições completas. - Cálculos simplificados facilitam a análise do transcriptoma ab initio. - Preparação de amostras sem a necessidade de transcrição reversa ou com viés de PCR reduzido. - A deteção de modificações na base de RNA é possível, incluindo a estimativa direta dos comprimentos das caudas de Poly(A) através de sequenciação de moléculas únicas.
Contras	- A preparação da amostra (transcrição reversa, PCR, seleção de tamanho) introduz viés. - Detecção e quantificação limitadas de isoformas. - Requer etapas de correspondência e/ou montagem do transcriptoma ab initio para a descoberta de transcritos.	- Baixo a médio rendimento: 500.000 a 10 milhões de leituras por corrida. - Vies de preparação de amostras presentes para a descoberta de guias, análise de transcriptoma ab initio e descoberta de transcritos de fusão. - Não recomendado para análise de RNA degradado.	- A tecnologia oferece uma baixa capacidade de processamento, atualmente variando entre 500.000 a 1 milhão de leituras por corrida. A compreensão da preparação de amostras e dos enviesamentos de sequenciação continua incompleta. - Capaz de detectar modificações no ácido ribonucleico (RNA).
Principais Aplicações	- DGEWTA, RNA pequena, análise de célula única, ómicas espaciais, montagem de RNA de novo, análise do translatoma, análise estrutural e de interação RNA-proteína, etc.	- Descoberta de isoformas, análise de transcriptoma ab initio, descoberta de transcritos de fusão, MHC, HLA ou outra análise complexa de transcritos.	- Descoberta de isoformas, análise de transcriptoma ab initio, descoberta de transcritos de fusão, MHC, HLA ou outra análise complexa de transcritos. - Capaz de identificar modificações no ácido ribonucleico (RNA).
Considerações Tecnológicas	- Alto rendimento com viéses conhecidos. - Fluxos de trabalho computacionais atendem a várias aplicações de análise de RNA.	- Vazão média com viéses na preparação de amostras. - Detecção direta de modificações de RNA.
Recomendações	- Adequado para uma ampla gama de aplicações de análise de RNA. - Não recomendado para análise de RNA degradado.	- Recomendado para descoberta de isoformas, análise de transcritos de fusão e análise de transcritos complexos. - Não é adequado para a análise de RNA degradado.	A sequenciação destaca-se em tarefas como a descoberta de isoformas, análise de transcriptoma ab initio, deteção de transcritos de fusão e a análise de transcritos complexos como MHC e HLA. No entanto, não é recomendado para a análise de RNA degradado.

Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.

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