Aplicação do Sequenciamento Sanger de Produtos de PCR

A PCR, uma técnica de clonagem genética amplamente utilizada, permite a replicação in vitro eficiente de fragmentos de DNA específicos. Utilizando a tecnologia PCR, podemos amplificar genes-alvo em quantidades suficientes, atendendo às exigências de sequenciação e análise subsequentes.

Na investigação atual, existem tipicamente dois métodos principais para a análise de sequências de produtos de PCR. Em primeiro lugar, utiliza-se o sequenciamento Sanger direto, adequado para detectar mutações genéticas com locais claros, como doenças hereditárias de gene único limitadas e identificação de populações microbianas, deteção de tipagem HLA (PCR-SBT), entre outros. Em segundo lugar, os produtos de PCR são submetidos à construção de vetores, empregando comumente vetores T, seguidos de transformação em Escherichia coli. Os passos subsequentes envolvem cultura, seleção de colónias e sequenciamento de clones únicos com análise aprofundada.

O âmbito de aplicação da tecnologia de sequenciação de produtos de PCR direta é extenso. Não é apenas utilizada para a deteção de mutações genéticas, mas também na identificação de populações microbianas, na deteção de tipagem HLA e na validação de resultados de NGS, oferecendo um suporte robusto para esforços de investigação científica.

Aplicação do Sequenciamento de Sanger na Análise de Produtos de PCR

Deteção de Mutação

Eventos mutacionais induzem variabilidade nas sequências de DNA. Sequenciação de Sanger, como um método de deteção eficiente e preciso, identifica eficazmente estas mutações, incluindo polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), inserções e deleções. A deteção de mutações desempenha um papel indispensável em domínios de investigação cruciais, como doenças hereditárias e cancro.

O processo básico de deteção de mutações é descrito da seguinte forma:

Em primeiro lugar, primers específicos são desenhados para sequências exónicas-alvo propensas a mutações, garantindo a captura precisa da região alvo. Em seguida, o DNA é extraído da amostra para servir como material base para os experimentos subsequentes.

Em seguida, as sequências de DNA-alvo são amplificadas utilizando técnicas de amplificação por PCR, e os produtos da amplificação são purificados para eliminar a influência da amplificação não específica e impurezas. Após a purificação dos produtos da amplificação, os seus tamanhos são determinados através de métodos como a eletroforese em gel para garantir que os produtos atendem às expectativas.

Subsequentemente, Sequenciação de Sanger dos produtos de amplificação é realizada para obter informações de sequência de DNA da região alvo. Após a conclusão do sequenciamento, o cromatograma de sequência obtido é comparado e analisado com a sequência de referência do gene alvo para identificar os locais de mutação existentes e os seus tipos.

Finalmente, para garantir a precisão e fiabilidade dos resultados de sequenciação, podem ser realizados passos de validação opcionais após a sequenciação. Isto pode ser alcançado através de métodos como kits de deteção de quantificação fluorescente (usando o método ARMS com uma sensibilidade de 1%), validando ainda mais a precisão dos resultados de deteção de mutações.

Métodos para a Detecção de Mutações BRAF. (a) Avaliação Comparativa da Profundidade e Abrangência nos Métodos de Detecção de Mutações BRAF. (b) Mecanismo para o Enriquecimento de Variantes por Amplificação de Deslocamento de Bloqueador (BDA). O Bloqueador liga-se seletivamente e inibe a amplificação por PCR de sequências de DNA tipo selvagem (WT), facilitando a amplificação preferencial de mutações BRAF. (c) Fluxo de Trabalho do Ensaios de Detecção de Mutações BDA. O ensaio BDA é inicialmente realizado em PCR quantitativa (qPCR), seguido de sequenciação de Sanger dos amplicons para identificar a mutação específica.

Identificação de Micróbios

Identificação de micróbios esforços para alcançar uma caracterização e classificação precisas de diversos microrganismos, incluindo bactérias, fungos, vírus e parasitas, utilizando Sequenciação de SangerApresenta-se abaixo uma descrição concisa do protocolo de identificação:

Inicialmente, o design meticuloso de primers específicos visa regiões conservadas representativas dentro do DNA microbiano de interesse, como o 16S rDNA para bactérias ou o Região ITS para fungos.

Após o design dos primers, a amplificação eficiente das regiões conservadas é realizada utilizando a tecnologia PCR para gerar um suprimento abundante de fragmentos de DNA necessários para a análise posterior.

Após a amplificação bem-sucedida, realiza-se o sequenciamento de primeira geração dos produtos de PCR para discernir com precisão as sequências de DNA, elucidando assim a composição genética dos microrganismos-alvo.

Após a obtenção dos resultados de sequenciação, são realizadas análises e alinhamentos rigorosos das sequências em comparação com repositórios genéticos globalmente reconhecidos, como o NCBI GenBank. Este alinhamento meticuloso facilita a determinação das relações entre espécies microbianas.

A totalidade do processo de identificação caracteriza-se pela sua natureza rigorosa e metódica, garantindo a precisão e a fiabilidade dos resultados de identificação, proporcionando assim um suporte robusto para a investigação microbiana e aplicações práticas.

Quantificar comunidades bacterianas através do sequenciamento Sanger. Aqui, os autores quantificam a composição de amplicões em comunidades bacterianas sintéticas através do sequenciamento Sanger. Eles amplificam por PCR um gene marcador universal e, posteriormente, sequenciam esta mistura de amplicões numa única reação de sequenciamento Sanger.

Tipagem HLA

Comparado com métodos baseados em PCR, como ensaios de sondas oligonucleotídicas específicas de sequência por PCR (baixa resolução) e amplificação de genes por primers específicos de sequência por PCR (resolução média), a tipagem por sequenciamento direto baseado em PCR (tipagem baseada em sequência, SBT) oferece uma resolução superior. Entre estas técnicas, o sequenciamento clássico de Sanger serve como uma abordagem de sequenciamento opcional para a tipagem por sequenciamento direto baseada em PCR.

O fluxo de trabalho é delineado da seguinte forma: Inicialmente, primers específicos do sítio são utilizados para amplificar seletivamente loci HLA críticos, garantindo a aquisição precisa de sequências-alvo. Subsequentemente, os produtos amplificados passam por Sequenciação de Sanger para obter informações abrangentes sobre a sequência base. Por fim, os resultados do sequenciamento são analisados minuciosamente utilizando software para adquirir tipagem de genes HLA de alta resolução informação. Ao longo deste processo, os resultados de sequenciação são alinhados com bases de dados HLA conhecidas para determinar com precisão o genótipo HLA específico de um indivíduo, ajudando na descoberta de novas variações alélicas.

Análise comparativa dos métodos de sequenciação NGS e Sanger para tipagem de HLA

Validação de Resultados de NGS

Dadas as incertezas multifacetadas que afetam a precisão de NGS, resultantes de variáveis como sistemas de enriquecimento direcionado, plataformas de sequenciação, pipelines de bioinformática e expertise em interpretação de variantes, ferramentas de validação fiáveis são indispensáveis para verificação comparativa. Entre estas, Sequenciação de Sanger a tecnologia, reconhecida pela sua capacidade de sequenciar um único segmento de fita de DNA de cada vez com uma precisão que atinge 99,99%, é amplamente reconhecida e consistentemente utilizada como o padrão de ouro para validação.

O processo de validação é resumido da seguinte forma:

Inicialmente, o design preciso de primers direcionados aos loci variantes identificados de NGS a deteção assegura a captura precisa das regiões-alvo. Subsequentemente, através da amplificação dos segmentos-alvo e purificação dos produtos, obtêm-se templates de sequenciação de alta qualidade. A seguir, Sequenciação de Sanger a tecnologia é utilizada para sequenciar os templates processados, obtendo informações de sequência detalhadas. Por fim, uma análise minuciosa dos resultados de sequenciamento de Sanger em relação aos loci variantes confirma a sua consistência com os resultados da deteção por NGS. Através deste rigoroso processo de validação, podemos avaliar com mais precisão a fiabilidade dos resultados de NGS, fornecendo um suporte robusto para a investigação científica subsequente ou para a tomada de decisões clínicas.

Sequenciação de DNA Mitocondrial

Sequenciação de DNA mitocondrial é uma técnica analítica precisa que visa loci específicos. Em casos de suspeitas de mutações em genes mitocondriais, amostras de sangue venoso periférico são primeiro recolhidas dos pacientes, a partir das quais o DNA genómico é extraído. Subsequentemente, técnicas avançadas NGS a tecnologia examina de forma abrangente toda a sequência do genoma mitocondrial do paciente. Com base nesses resultados preliminares de deteção, é realizada uma análise de validação adicional do DNA mitocondrial do paciente utilizando o Sequenciação de Sanger método em amostras obtidas dos pais e irmãos do paciente para garantir a precisão e fiabilidade dos resultados. Através desta série de processos de sequenciação rigorosos, são fornecidas evidências genéticas moleculares robustas para o diagnóstico clínico e tratamento.

Dada a reputação estimada do sequenciamento de Sanger pelas suas características de alta precisão, o seu princípio de deteção fundamental reside na capacidade de ler sequências de DNA com precisão, base a base. Assim, o controlo meticuloso da qualidade dos produtos de PCR, incluindo a sua concentração e pureza, é crucial para o sucesso do sequenciamento de Sanger.

Sequenciação Sanger de mtDNA. Eletroferogramas gerados pela sequenciação dideoxi Sanger de mtDNA extraído de três restos ósseos antigos encontrados numa sepultura do século X em Sigtuna, na Suécia central. (Martina Nilsson)

Otimização do Sequenciamento de Sanger: Resolução de Problemas Comuns

Durante a fase preparatória de Sequenciação de SangerA otimização contínua das condições experimentais é necessária para maximizar a qualidade e a precisão da sequência. Isso envolve, entre outros aspectos, o ajuste fino do design dos primers de PCR e a ajustagem precisa das condições da reação de PCR. Além disso, a purificação dos produtos após a reação de PCR é indispensável. Este passo tem como objetivo remover efetivamente impurezas, como fragmentos amplificados não específicos e sequências de primers, garantindo assim a precisão da sequência do gene alvo.

No entanto, na operação prática, fatores como a concentração, pureza e estrutura dos produtos de PCR a serem sequenciados podem levar a uma série de resultados de sequenciamento subotimais. Para resolver isso, compilámos uma lista de problemas comuns e estratégias de resolução correspondentes para referência prática.

Referências:

1. Cheng, L.Y., Haydu, L.E., Song, P. et al. Detecção de mutações BRAF em espécimes de tecido FFPE de melanoma metastático por sequenciação Sanger de alta sensibilidade. Relatórios Científicos 11, 9043 (2021).
2. Cermak N, Datta MS, Conwill A. Medição Rápida e Barata da Composição de Comunidades Bacterianas Sintéticas através do Sequenciamento Sanger de Misturas de Amplicões. iCiência. 2020
3. Syndercombe Court D. DNA mitocondrial em uso forense. Emerg Top Life Sci. 2021