Guia de Controlo de Qualidade para Sequenciação Viral

A sequenciação viral evoluiu para uma ferramenta sofisticada, capacitando os investigadores a desvendar as complexidades dos genomas virais e as suas implicações na saúde humana. À medida que nos aprofundamos no domínio da genómica viral, passos meticulosos de controlo de qualidade (CQ) tornam-se indispensáveis para garantir a fidelidade e a precisão dos dados de sequenciação. Neste guia abrangente, iremos explorar as complexidades das medidas de CQ em diferentes etapas da sequenciação viral, incluindo técnicas avançadas e detalhes tecnológicos.

Leia o nosso artigo sobre O Fluxo de Trabalho da Metagenómica Viral.

Avaliação do Processo de Extração de RNA Viral

A pedra angular de um protocolo de sequenciação viral resiliente reside na extração meticulosa de RNA viral de alta qualidade. Esta etapa processual permanece suscetível a variações inerentes decorrentes de diferentes tipos de amostras, metodologias de extração e possíveis contaminantes. Um regime rigoroso de controlo de qualidade serve para salvaguardar a integridade imaculada e a pureza intocada das amostras de RNA obtidas:

• Análise da Integridade do RNA: Utilize plataformas de eletroforese microfluídica de ponta, exemplificadas por Bioanalyzer ou TapeStation, para gerar Números de Integridade do RNA (RIN). Valores elevados de RIN, aproximando o pico de 10, significam degradação nominal, mantendo assim a representação verídica do RNA viral.
• PCR Quantitativa (qPCR): Utilize a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) para medir a concentração de RNA, garantindo assim a disponibilidade de material adequado para as metodologias subsequentes. Além disso, realize uma quantificação da contaminação residual de DNA, um fator potencialmente prejudicial que pode afetar a veracidade dos resultados.

Controlo de Qualidade de DNA Viral ou cDNA

No domínio dos fluxos de trabalho de preparação de bibliotecas, é uma necessidade comum fragmentar DNA ou cDNA. Um passo crucial neste processo envolve a realização de uma avaliação de qualidade meticulosa para garantir que o DNA fragmentado se alinha com os parâmetros de tamanho apropriados antes de avançar.

• Fragmentação de DNA ou cDNA: Este passo envolve a quebra das moléculas de DNA ou cDNA em fragmentos menores. É uma etapa crucial na preparação de bibliotecas para sequenciação.
• Verificação do Tamanho: Após o processo de fragmentação, uma estratégia crítica envolve a validação meticulosa de se os fragmentos resultantes harmonizam com o espectro de tamanho antecipado. A eficácia do próximo esforço de sequenciação encontra seu fundamento na veracidade deste aspecto processual particular. A elucidação visual da distribuição de tamanhos das entidades de ácido nucleico fraturadas é realizada através de plataformas de eletroforese microfluídica, tipificadas pelo Bioanalyzer.
• Visualização do Perfil de Tamanho: O Bioanalyzer, em conjunto com aparelhos análogos, manifesta-se como uma ferramenta de excelência na representação da distribuição dimensional dos fragmentos de DNA ou cDNA. Estes instrumentos conferem a capacidade de apreender o espectro de tamanho e o contorno dos fragmentos, corroborando assim a sua conformidade com os parâmetros de tamanho estipulados.
• Purificação se Necessário: Se os fragmentos não estiverem na faixa de tamanho correta, a amostra pode precisar ser purificada para remover fragmentos indesejados ou de tamanho inadequado.
• Preocupações com Contaminação Cruzada: O uso de eletroforese clássica para visualização e extração da região de interesse pode levar a um risco de contaminações cruzadas entre amostras. Assim, sistemas modernos utilizam canais separados para cada amostra, eliminando a possibilidade de contaminação cruzada durante a análise.
• Confirmação do Tamanho do Fragmento: Uma vez confirmada a faixa de tamanho correta, o próximo passo é verificar o tamanho do fragmento das amostras de DNA ou cDNA. Alguns sistemas permitem uma análise precisa dos tamanhos dos fragmentos e fornecem visualização de alta resolução.
• Conservação da Amostra para Sequenciação: O uso dos sistemas de análise requer apenas um pequeno volume da amostra original (1-2 uL). Esta conservação do volume da amostra original garante que haja material suficiente para o processo de sequenciação.

Controlo de Qualidade na Detecção de Mutação Viral

Desvendar mutacões virais exige estratégias de CQ meticulosas, particularmente na era de variantes emergentes:

• Sequenciação Ultra-Profunda: Aproveite a sequenciação profunda com alta cobertura em todo o genoma viral. Analise a frequência e a distribuição de mutações utilizando ferramentas como VarScan ou GATK, aumentando assim a sensibilidade na deteção de mutações.
• Validação de Material de Referência: Integre materiais de referência bem caracterizados que contenham mutações conhecidas. Valide a capacidade do seu pipeline de detectar mutações com precisão utilizando estes controles, assegurando uma base fiável para a análise de mutações.

Controlo de Qualidade na Detecção de Vírus

O objetivo final da sequenciação viral é a deteção precisa de vírus. Desvende este domínio com uma fusão de metodologias de CQ convencionais e de ponta:

• Microfluídica Digital: Aproveite a microfluídica digital para compartimentar e amplificar moléculas virais únicas. Esta abordagem amplifica a sensibilidade, permitindo a deteção de amostras virais de baixo título.
• Análise de Sensibilidade e Especificidade: Estabeleça benchmarks de sensibilidade e especificidade utilizando isolados clínicos com diferentes cargas virais. A análise da curva ROC quantifica a capacidade do ensaio de discriminar verdadeiros positivos de falsos positivos.

Resumo

A sequenciação de vírus desempenha um papel crucial não apenas na deteção, mas também no rastreamento, monitorização e identificação de novas variantes. A utilidade da sequenciação de nova geração (NGS) abrange múltiplas aplicações estabelecidas. Garantir a fiabilidade dos resultados de sequenciação depende de passos meticulosos de controlo de qualidade. Estes passos são vitais na avaliação da solidez, peso molecular e concentração dos ácidos nucleicos e bibliotecas iniciais. Quer se trate de cargas de trabalho modestas ou extensas, estes sistemas contribuem significativamente para alcançar um controlo de qualidade (CQ) consistente e eficaz das amostras. Esta compilação é baseada em diversas fontes e pesquisas na literatura.