O Fluxo de Trabalho da Metagenómica Viral

Como Funciona a Metagenómica Viral

Como é do conhecimento geral, a maioria dos vírus infecta microrganismos, plantas e animais. Eles causam doenças infecciosas familiares (como a gripe e verrugas) e até algumas doenças graves, como a varíola, o Ébola e o VIH/SIDA. Como menos de um por cento dos hospedeiros microbianos foram cultivados, é muito vital identificar e medir a dinâmica comunitária dos vírus no ambiente. Ao contrário das bactérias e fungos, não existem genes evolutivamente conservados, portanto, não é viável monitorizar a diversidade viral utilizando abordagens análogas a Sequenciação de amplicões 16S/18S/ITS. Metagenómica viral pode fornecer informações sobre a composição e estrutura das comunidades virais.

O fluxo de trabalho da metagenómica viral inclui a recolha de amostras, purificação de partículas semelhantes a vírus, extração de ácidos nucleicos, preparação de bibliotecas e sequenciação metagenómicaÉ semelhante ao fluxo de trabalho de metagenómica, mas diferem em alguns passos. Primeiro, é essencial enriquecer os virões. Em segundo lugar, para vírus de RNA, os RNAs virais precisam ser convertidos em cDNA.

Figura 1. Diagrama de fluxo para análise metagenómica de vírus (Cholleti et al. 2018).

Passos de Purificação de Partículas Virais em Metagenómica Viral

É complicado isolar DNA comunitário representativo na presença de DNA livre e celular. A média do genoma viral (~50 kb) é cerca de 50 vezes menor do que a média do genoma microbiano (~2,5 Mb). Assim, o sinal de DNA viral será sobrecarregado pela contaminação celular se o DNA livre não for removido. Aqui, usamos amostras de esgoto e clínicas como exemplos para introduzir como enriquecer virões.

Amostra de esgotoInicialmente, 25 mL de tampão de glicina (0,05 M de glicina, 3% de extrato de carne, pH 9,6) é adicionado a 200 mL de esgoto e misturado, a fim de descolar partículas virais ligadas a material orgânico. A amostra é então centrifugada a 8.000×g durante 30 min. O sobrenadante é coletado e filtrado através de uma membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 μm para remover células procarióticas e eucarióticas. Os vírus são precipitados do sobrenadante por incubação com PEG 8000 (80 g/L) e NaCl (17,5 g/L) durante agitação (100 rpm) durante a noite a 4˚C, seguido de centrifugação por 90 min a 13.000×g. O pellet contendo vírus resultante é eluído em 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e armazenado a -80˚C antes de processamento adicional.

Amostra clínicaAntes da purificação de partículas virais, é necessário preparar um homogeneizado de tecido. Para a homogeneização, um pequeno cubo de tecido (cerca de 0,5-1 cm³) é colocado num tubo de rosca autoclavado contendo 1 mL de tampão PBS e 20-30 esferas de cerâmica estéreis. O tecido é desfeito agitando 4 vezes à velocidade máxima em intervalos de 15 s, utilizando o Instrumento FastPrep-24. A duração deste procedimento foi de aproximadamente 0,5 h. Kohl et al. (2015) descreveram mais informações sobre a purificação de vírus em espécimes clínicos (Figura 2).

Figura 2. Descrição esquemática do protocolo de enriquecimento universal de vírus baseado em clínica para metagenómica viral (Kohl et al. 2015).

Após a purificação das partículas virais, todos os concentrados virais são tratados com DNase I e RNase a 37°C durante 15 minutos para remover o ácido nucleico extracelular, em seguida, as enzimas são desativadas a 70°C durante 5 minutos.

Extração de ácidos nucleicos virais em Metagenómica Viral

No método tradicional, uma vez que os virões são isolados, o metagenoma viral é então extraído e clonado. Clonar metagenomas virais representativos continua a ser um desafio, devido às baixas concentrações de ácidos nucleicos (~10-17g de DNA por virion), DNA modificado e à presença de genes virais letais, como lisossomas e holinas. Para resolver este problema, Edwards et al. (2005) desenvolveram a solução. Primeiro, é necessário obter virions suficientes para clonagem. Em seguida, a técnica de biblioteca de shotgun amplificada por ligador (LASL) torna possível clonar pequenas quantidades de DNA e converte DNA modificado em DNA não modificado através de uma etapa de amplificação por PCR. Uma etapa de fragmentação, então, interrompe os genes virais letais fragmentando o DNA em pequenos fragmentos (~2 kb). Assim, é possível fazer representativo metagenómica bibliotecas.

Hoje em dia, existem muitos kits excelentes para a preparação de ácidos nucleicos virais, como QIA (Qiagen), NUC (Macherey-Nagel), MIN (BioMerieux) e POW (MO BIIO). Para vírus de RNA, o RNA precisa ser convertido em cDNA. Alternativamente, o genoma viral de RNA pode ser purificado com o Reagente TRIzol-LS® e o genoma viral de DNA pode ser purificado através da extração com fenol a partir de partículas virais purificadas. A concentração de DNA/RNA viral purificado deve ser quantificada utilizando as tecnologias RiboGreen® ou PicoGreen®. Se a quantidade de ácido nucleico não for suficiente para uma análise posterior, a amplificação do DNA/cDNA pode ser realizada utilizando um kit de amplificação de genoma/transcriptoma completo.

Sequenciação Metagenómica e Análise Bioinformática em Metagenómica Viral

NGS a preparação da biblioteca é realizada utilizando kits adequados que dependem da plataforma de sequenciação escolhida. As plataformas comuns para sequenciação metagenómica viral inclui Illumina MiSeq e HiSeq, PacBio RS II, entre outros. O básico bioinformática pipeline para metagenómica viral incluir verificação de qualidade (identificação e remoção de duplicados de sequência e bases de baixa qualidade), mapeamento do genoma do hospedeiro (utilizando várias ferramentas de alinhamento de leituras curtas, como SOAP2, BWA e Bowtie2) e classificação taxonómica de sequências virais.

Figura 3. A análise informática básica da metagenómica viral (Cholleti et al. 2018).

Referências:

1. Cholleti H, Berg M, Hayer J, et al. Vírus transmitidos por vetores e a sua deteção através de metagenómica viral. Ecologia e Epidemiologia da Infeção, 2018, 8(1): 1553465.
2. Hjelmsø M H, Hellmér M, Fernandez-Cassi X, et al. Avaliação de métodos para a concentração e extração de vírus de águas residuais no contexto de sequenciação metagenómica. PLoS One, 2017, 12(1): e0170199.
3. Kohl C, Brinkmann A, Dabrowski P W, et al. Protocolo para deteção metagenómica de vírus em espécimes clínicos. Doenças infecciosas emergentes, 2015, 21(1): 48.
4. Parras-Moltó M, López-Bueno A. Métodos para Enriquecimento e Sequenciação de Conjuntos Virais Orais: Saliva, Mucosa Oral e Viromas de Placa Dentária // O Viroma Humano. Humana Press, Nova Iorque, NY, 2018: 143-161.