Primers de Sequenciação

O que é um primer de sequenciação?

Os primers de sequenciação são oligonucleotídeos de DNA curtos utilizados em métodos de sequenciação de DNA. Estes primers fornecem um ponto de partida para a síntese de DNA durante a reação de sequenciação.

Primers de sequenciação na sequenciação Sanger

Em Sequenciação de Sanger, que também é conhecido como sequenciação por terminação de cadeia, primers de sequenciação são usados para iniciar a síntese de DNA em uma molécula de DNA molde. Estes primers são complementares a uma região específica do molde de DNA que precisa ser sequenciada. A reação de sequenciação envolve a incorporação de dideoxinucleotídeos (ddNTPs) marcados fluorescentemente na cadeia de DNA em crescimento, o que termina a elongação da cadeia em cada posição, resultando numa série de fragmentos de comprimentos variados. Estes fragmentos são então separados por tamanho usando eletroforese capilar, e a sequência é determinada com base na ordem dos fragmentos terminados.

Primers de sequenciação em NGS

Em sequenciação de nova geração técnicas, como o sequenciamento Illumina, os primers de sequenciamento também são utilizados para iniciar a síntese de DNA. No entanto, o processo de sequenciamento difere do sequenciamento Sanger. As plataformas de NGS utilizam sequenciamento massivamente paralelo, onde muitas reações de sequenciamento são realizadas simultaneamente de forma de alto rendimento. Os primers de sequenciamento nos métodos de NGS contêm tipicamente sequências de adaptadores que são necessárias para a ligação dos fragmentos de DNA à superfície sólida ou célula de fluxo da plataforma de sequenciamento. Estes adaptadores facilitam a amplificação e o sequenciamento dos fragmentos de DNA de uma maneira massivamente paralela, gerando milhões de sequências curtas de DNA em uma única corrida de sequenciamento.

Quais são os princípios do design de primers de sequenciamento?

Os primers de sequenciação são frequentemente divididos em primers universais de sequenciação de vetor e primers de sequenciação específicos de genes:

Primers de sequencia universal para vetores de plasmídeo

Ambas as extremidades do MCS (local policlonal), e depois simplesmente colocar os primers de sequencia na posição das extremidades do fragmento, ou seja, os primers desenhados de acordo com a sequência do vetor, as empresas de sequenciamento em geral têm uma parte de primers universais gratuitos que podem ser utilizados, estes primers são alguns comuns. vetores comerciais utilizados em primers de sequenciação, como o vetor pCDNA3.1, ou o vetor pGL3-Basic, e claro, outros vetores.

Requisitos gerais para primers de especificidade universal de vetor:

(1) Especificidade: requer apenas um sítio de ligação à sequência do vetor;

(2) Posição: são necessários pelo menos 100 bases a partir do fragmento inserido; muito próximo pode levar a sequências imprecisas nas extremidades do fragmento inserido.

(3) Comprimento: 17 a 25 bases são suficientes

(4) Conteúdo de GC: sem requisitos especiais, tente estar acima de 35%

(5) Valor Tm: sem requisitos especiais, tente estar acima de 40.

(6) requisitos de síntese: preferencialmente purificação por PAGE, a desalinização também é possível, eu mesmo uso primers desalinizados sem problemas.

Primers de sequenciação específicos de genes

Geralmente, quando o comprimento do fragmento inserido excede 1500 bp, precisamos projetar sequenciação específica de genes Primers, quantos é necessário desenhar, que simplesmente de acordo com um comprimento de leitura eficaz do primer de sequenciamento de 700bp, como o fragmento inserido de 2500bp, então pelo menos quatro primers de sequenciamento, dois primers de sequenciamento universais, dois primers de sequenciamento específicos de genes.

Requisitos gerais para primers de sequenciação específicos de genes:

(1) Especificidade: ligação ao template de sequenciação, sem desvios de mais de 4 bases.

(2) Posição: Quando é necessário desenhar mais do que um primer, a sobreposição entre o comprimento de sequenciamento do primer anterior e o próximo primer de sequenciamento deve ser de pelo menos 100 bases, caso contrário, os dois primers de sequenciamento podem não se sobrepor, e o primer de sequenciamento precisa ser desenhado novamente. Essa é a mesma razão para primers universais de vetor e primers específicos de gene.

(3) Comprimento: 17-25 bases

(4) Conteúdo de GC: sem requisitos especiais, tente estar acima de 35%

Valor Tm: sem requisitos especiais, tente estar acima de 40.

(6) Requisitos de síntese: preferencialmente purificação por PAGE, a desalinização também é possível.

Design de primers para sequenciação Sanger

Em Sequenciação de Sanger experimentos, a maioria dos primers de PCR pode ser utilizada como primers de sequenciação para reações de sequenciação, mas alguns primers de PCR não podem ser utilizados para reações de sequenciação, principalmente devido às seguintes razões:

(1) Primers simples: primers simples frequentemente têm múltiplos locais de ligação no template de sequenciação, o que afeta diretamente os resultados da sequenciação.

(2) Primers aleatórios: os primers aleatórios (como os primers RAPD) são geralmente curtos, e a temperatura de anelamento utilizada é baixa, o que não permite uma boa ligação ao molde nas condições da reação de sequenciação.

(3) Primers com fragmentos demasiado longos: Geralmente, os primers de sequenciação não devem ter mais de 24 bp, e primers demasiado longos têm maior probabilidade de se ligarem a múltiplos locais de ligação presentes no template de sequenciação sob as condições de reação de sequenciação mais baixas, resultando em maior ruído; além disso, a pureza de primers mais longos também será difícil de garantir, sendo que a pureza dos primers utilizados para sequenciação deve ser superior a 90%, e quando a pureza dos primers é baixa, o sinal de fundo da reação de sequenciação será significativamente mais alto, o que afeta diretamente a precisão dos resultados de sequenciação.

(4) Primers especialmente rotulados: todas as quatro bases na reação de sequenciação Sanger estão rotuladas fluorescentemente, e primers rotulados fluorescentemente utilizados na reação de sequenciação gerarão interferência com o sinal de fluorescência; além disso, primers rotulados com outros tipos de macromoléculas também são inadequados para reações de sequenciação, e os grupos macromoleculares rotulados nos primers afetarão diretamente a mobilidade dos fragmentos de DNA, resultando em uma forma de pico pobre ou incorreta nos resultados da sequenciação.

(5) Primers com baixa pureza: os primers de sequenciação têm elevados requisitos de pureza, e substâncias estranhas misturadas nos primers sintéticos podem levar a um aumento do ruído, o que afeta diretamente a qualidade da sequenciação.

Seleção de primers na sequenciação de 16S/18S/ITS

Diferentes espécies de bactérias têm a mesma sequência de região conservada e diferentes sequências de região variável. Podem ser desenhados primers para amplificar todos. genes 16SrRNA bacterianos em amostras ambientais com base nas sequências das regiões conservadas, enquanto diferentes espécies de bactérias podem ser distinguidas com base nas sequências das regiões variáveis.

Os primers mais utilizados em métodos tradicionais são 27F e 1492R, que podem amplificar quase todo o comprimento do gene completo 16SrRNA, o que não é aplicável às plataformas de sequenciamento de alto rendimento devido à atual limitação do comprimento de leitura do NGS, mas é amplamente utilizado para a identificação molecular de bactérias puras. Considerando a atual limitação do comprimento de leitura das plataformas de sequenciamento de alto rendimento mais utilizadas, apenas uma certa região variável do 16SrDNA pode ser sequenciada. Alguns escolhem sequenciar uma única região V (V3/V4/V6), outros a dupla região V (região V3-V4 ou região V4-V5), e alguns optam pela tripla região V (região V1-V3, região V5-V7 ou região V7-V9) para sequenciamento de 16S rDNA na literatura.

Em geral, as regiões de sequenciamento mais utilizadas e reconhecidas para a nossa microbiómica ambiental são V3-V4, V4-V5 ou apenas a região V4. Muitos primers de sequenciamento 16S estão documentados no Projeto Microbioma da Terra, incluindo os primers tradicionais 515F/806R e sequências de primers otimizadas 515F/806R.

Primer na sequenciação do gene 16S rRNA. (Abellan-Schneyder et al., 2021)

De forma semelhante, os genes de rRNA 18S são sequências de DNA que codificam subunidades pequenas de ribossomas eucarióticos, com regiões conservadas e variáveis (V1-V9, sem a região V6). As regiões conservadas refletem as afinidades entre espécies biológicas, enquanto as regiões variáveis refletem as diferenças entre espécies e são adequadas como critérios taxonómicos ao nível das espécies e acima. A V4 é a escolha mais utilizada para a anotação da análise do gene de rRNA 18S, com a informação de base de dados mais completa e a melhor classificação. Em fungos, os genes de rRNA 5.8S, 18S e 28S são altamente conservados, enquanto o ITS apresenta um polimorfismo de sequência extremamente amplo na vasta maioria dos eucarióticos, devido a uma menor pressão da seleção natural e à capacidade de tolerar mais variação durante a evolução. Ao mesmo tempo, o tipo conservado de ITS mostra uma consistência relativamente alta dentro das espécies e diferenças mais óbvias entre espécies, o que pode refletir as diferenças entre géneros e até mesmo estirpes. Os fragmentos de sequência do ITS são pequenos (350 bp e 400 bp para ITS 1 e ITS 2, respetivamente) e fáceis de analisar, tendo sido amplamente utilizados na análise filogenética de diferentes espécies de fungos.

Arqueobactérias, também conhecidas como arqueias, são uma classe muito especial de bactérias que apresentam algumas características tanto de procariotos como de eucariotos. Estudos demonstraram que os pares de primers 519F/915R e 344F/915R têm a melhor especificidade para arqueobactérias. Existe uma preferência por pares de primers adaptados a diferentes plataformas, e para a plataforma de sequenciação Illumina MiSeq 2×300 bp, o primer 519F/915R é o mais adequado (região 16S V4V5).

Referência:

1. Abellan-Schneyder, Isabel, et al. "Primer, pipelines, parâmetros: questões na sequenciação do gene 16S rRNA." Msphere 6.1 (2021): e01202-20.