Fluxo de Trabalho de Extração Rápida de DNA: Complete o Seu Projeto de NGS

Por que a Velocidade é Importante na Extração de DNA NGS

Em ambientes de investigação de alto risco—especialmente em CROs, P&D farmacêutico e laboratórios académicos—o tempo pode ser um fator limitante. A extração rápida de DNA reduz os prazos dos projetos, permitindo que o sequenciamento comece mais cedo sem comprometer a qualidade dos dados. Esta abordagem acelerada ajuda a prevenir atrasos subsequentes na preparação de bibliotecas e no sequenciamento, o que, por sua vez, acelera a entrega de dados e a tomada de decisões para projetos críticos.

Além disso, estudos mostram que a automação de laboratórios reduz significativamente a carga de trabalho manual—alguns fluxos de trabalho podem ser configurados em menos de 30 minutos—mantendo uma qualidade de extração comparável aos métodos tradicionais. Dado que a isolação de ácidos nucleicos é universalmente reconhecida como o primeiro passo crítico em qualquer pipeline de NGS, otimizar esta fase para velocidade pode aumentar substancialmente o rendimento sem sacrificar a integridade do sequenciamento subsequente.

Princípios Fundamentais de um Fluxo de Trabalho de Extração Acelerado

Acelerar eficientemente a fase de extração de DNA sem comprometer a qualidade exige um fluxo de trabalho estratégico baseado em princípios-chave:

• Lise Eficiente – A libertação rápida de DNA das células é alcançada utilizando tampões de lise otimizados (comumente SDS ou agentes enzimáticos) combinados com uma leve destruição mecânica. Isso garante um alto rendimento e pureza, mesmo a partir de tipos de amostras complexas como tecidos ou culturas microbianas.
• Remoção Eficaz de Inibidores – Protocolos disponíveis comercialmente enfatizam consistentemente a importância crítica de limpar o DNA de proteínas residuais, sais e inibidores orgânicos. As etapas de limpeza baseadas em esferas magnéticas ou colunas de sílica são vitais para preparar extratos adequados para fluxos de trabalho de sequenciação.
• Automação para Minimizar o Tempo de Manipulação – A integração de sistemas automatizados de manuseio de líquidos (por exemplo, KingFisher™, Opentrons OT-2, Roche MagNA Pure) reduz significativamente o tempo de manipulação—frequentemente em 70-80%—e melhora a consistência entre lotes. Por exemplo, um estudo que utilizou preparação de bibliotecas automatizada viu o esforço manual diminuir de cerca de 125 minutos para apenas 25 minutos para oito amostras.
• Controlo de Qualidade (CQ) Simplificado – A incorporação de verificações de CQ paralelas—como ensaios fluorométricos (por exemplo, Qubit) e absorção UV (A260/280)—diretamente no fluxo de trabalho permite a validação imediata da qualidade da extração, garantindo que apenas DNA de alta integridade prossiga para sequenciação.
• Sincronização de Processos Sequenciais – Um pipeline acelerado sincroniza etapas como homogeneização de amostras, lise, limpeza e controlo de qualidade em lotes sobrepostos. Isso permite uma operação contínua onde, por exemplo, um lote está a passar por lise enquanto outro está a ser limpo, maximizando assim a capacidade de produção.

Ao convergir estes princípios—lisagem otimizada, purificação rigorosa, automação, controlo de qualidade integrado e design de fluxo de trabalho sincronizado—é possível alcançar um pipeline de extração rápido e robusto, permitindo que os laboratórios acelerem significativamente os prazos dos projetos de NGS, mantendo a qualidade dos dados essencial para o sequenciamento posterior.

Protocolo de Extração Rápida Passo a Passo

Este SOP simplificado adota as melhores práticas para processamento rápido e paralelo, preservando a integridade do DNA e a compatibilidade com pipelines de NGS:

Amostra de Recibo e Homogeneização

Rotule as amostras à chegada. Para amostras de tecido ou sólidas, homogeneize imediatamente (por exemplo, utilizando esferas de batimento) para garantir uma completa disrupção celular e consistência em todos os fluxos de trabalho.

Lise Rápida (Enzimática + Mecânica Suave)

Adicione o tampão de lise (por exemplo, tiocianato de guanidina com SDS e DTT) com uma incubação rápida da enzima de 5 a 10 minutos a 55–65 °C, acompanhada de agitação suave para acelerar a degradação da parede celular e da membrana.

Ligação de DNA (Sílica ou Esferas Magnéticas)

Adicione imediatamente uma solução de ligação contendo esferas de sílica ou paramagnéticas. Incube brevemente (≥5 minutos) para permitir a adsorção do DNA. Isto suporta a pureza e a rapidez em comparação com a precipitação tradicional.

Série de Lavagem de Contas

Transfira o DNA ligado a beads (magnéticos) ou a sílica para os tampões de lavagem para remover proteínas e inibidores. Normalmente envolve 2 a 3 lavagens à base de etanol, com secagem breve para remover o álcool residual.

Integração de QC Paralela

Enquanto a lavagem das beads ocorre, aloque alíquotas para QC imediato utilizando medições de Qubit e A260/280. Isso permite a deteção precoce de falhas e previne o desperdício de processamento posterior.

Eluição em Tampão de Sequenciação

Elua o DNA diretamente em um tampão de eluição limpo (por exemplo, 10 mM Tris, pH 8,5) pré-aquecido a 65 °C; incube durante 5 minutos. Isto garante a prontidão para a preparação da biblioteca. Os rendimentos típicos demoram menos de 5 minutos.

Organização por Placa

Realize a sequência para múltiplas amostras em paralelo dentro de uma placa de 96 poços ou suporte de múltiplos tubos. Por exemplo, a homogeneização permanece isolada enquanto os passos subsequentes baseados em placa decorrem em simultâneo para maximizar a produtividade.

Entrega Imediata para Preparação de Biblioteca

Transfira os eluídos diretamente para o fluxo de trabalho de preparação da biblioteca (por exemplo, tagmentação ou fragmentação + ligação de adaptadores), preservando a qualidade do DNA ao minimizar os ciclos de congelação-descongelação.

Este fluxo de trabalho completo—desde a receção da amostra até ao DNA pronto para preparação de biblioteca—pode ser concluído em 30 a 45 minutos para pequenos lotes (≤8 tubos) e em menos de 90 minutos para placas de 96 poços completas quando automatizado. Vários estudos confirmam que protocolos rápidos baseados em microfluídica ou em esferas produzem DNA de qualidade e compatibilidade suficientes para NGS e análises subsequentes.

Compromissos entre Qualidade e Velocidade e Mitigações

Embora a extração rápida de ADN possa acelerar drasticamente os fluxos de trabalho de NGS, introduz vários compromissos potenciais que devem ser geridos com cuidado:

Fragmentação e Redução do Rendimento

Métodos rápidos (por exemplo, protocolos à base de NaOH ou enzimáticos) frequentemente produzem fragmentos de DNA mais curtos e rendimentos mais baixos do que os métodos tradicionais de CTAB ou fenol–clorofórmio. Por exemplo, o DNA extraído com NaOH pode ser suficiente para PCR e sequenciação, mas com um tamanho de fragmento e concentração visivelmente reduzidos — aceitável para fluxos de trabalho de amplicão direcionado, mas não ideal para necessidades de alto peso molecular (por exemplo, sequenciação de leitura longa).

Inibidores Co-purificados

Protocolos rápidos simplificados podem falhar em remover suficientemente inibidores (por exemplo, polissacarídeos, polifenóis vegetais), o que pode impactar reações enzimáticas subsequentes. Em estudos baseados em plantas, a extração com NaOH mostrou um desempenho inferior em aplicações de diagnóstico que requerem DNA altamente puro.

Estratégias de Mitigação

• Incorpore etapas de lavagem adicionais ou protocolos baseados em esferas de limpeza para eliminar os inibidores remanescentes.
• Selecione kits rápidos validados para o seu tipo de amostra—muitos kits agora incluem etapas adaptadas para amostras de solo, FFPE ou com alto teor de lípidos.
• Incorpore pontos de controlo de QC (fluorometria, absorção UV, análise de fragmentos) desde o início e inclua uma amostra de reserva para identificar rapidamente extratos subótimos antes de etapas posteriores dispendiosas.

Ao equilibrar proativamente o processamento rápido com a limpeza e o controlo de qualidade direcionados, os laboratórios podem evitar armadilhas comuns e manter uma alta qualidade de dados—mesmo em fluxos de trabalho acelerados.

Otimização do Fluxo de Trabalho através da Sequenciação de Aplicações

Ajustar o seu fluxo de trabalho de extração rápida de DNA para corresponder às aplicações de sequenciação a jusante garante uma compatibilidade, rendimento e desempenho ótimos em diferentes plataformas de NGS:

1. Sequenciação do Genoma Completo (WGS, Leitura Curta)

RequisitosEntrada de DNA moderada (≥200 ng), A260/280 ~1,8, tamanho do fragmento >10 kb.

OtimizaçãoUtilize extração rápida baseada em esferas com controlo de qualidade duplo (fluorometria + UV). Protocolos rápidos são adequados para gerar bibliotecas dentro de um cronograma apertado de 24-48 horas, especialmente quando processados em lote.

2. Sequenciação do Exoma Completo (WES)

RequisitosEntrada total inferior (~100–200 ng) e comprimentos de fragmentos semelhantes aos do WGS.

OtimizaçãoA extração rápida é ideal aqui—painéis direcionados toleram uma preparação mais rápida; ainda assim, realize QC duplo. O WES reduz a carga de dados, acelerando o tempo de resposta da bioinformática.

Fluxo de trabalho mostrando sequenciação do genoma completo.Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se você tiver um texto específico que gostaria que eu traduzisse, por favor, forneça-o e ficarei feliz em ajudar!)

3. Painéis de Sequenciação Direcionada

RequisitosAlta pureza, 50–100 ng de entrada, compatibilidade com preparação baseada em ligadura ou tagmentação.

OtimizaçãoA extração rápida satisfaz estas necessidades de forma eficaz. Por exemplo, painéis direcionados baseados em sangue foram testados em pipelines ultra-rápidos concluídos em poucas horas.

Fluxo de trabalho de sequenciação de próxima geração direcionada (https://doi.org/10.1186/s12920-019-0527-2)

4. Sequenciação de Longa Leitura (PacBio HiFi, ONT)

RequisitosDNA de alto peso molecular (HMW), fragmentos de ≥20–30 kb, ≥2–5 µg de entrada total.

OtimizaçãoProtocolos rápidos são suficientes para fragmentos curtos, mas para aplicações de leitura longa, complemente com kits focados em HMW (por exemplo, Nanobind) e siga as melhores práticas: pipetagem mínima, limpeza baseada em esferas e incorporação de QC suave.

5. Fluxos de Trabalho de Sequenciação Híbrida ou Adaptativa

RequisitosCoexistência de dados de leituras curtas e longas ou enriquecimento direcionado.

OtimizaçãoExtrair utilizando um protocolo rápido de médio rendimento que preserve a integridade dos fragmentos. Abordagens adaptativas de leitura longa, como a seleção em tempo real da ONT (por exemplo, TaLon-SeqMD), são compatíveis com extrações rápidas, com um controlo de qualidade cuidadoso para manter os comprimentos dos fragmentos ≥5–10 kb.

Resumo:

• WGS/WES/Alvo: A extração rápida poupa tempo e é eficaz, apoiada por QC essencial.
• Leitura Longa/Híbrida: Requer passos adicionais para preservar o DNA de alto peso molecular, mas fluxos de trabalho rápidos ainda podem encaixar-se em pipelines de sequenciação acelerada.

Escalonamento de Vazão: De 1 a 96+ Amostras

A escalabilidade da extração de ADN de tubos únicos para formatos de alto rendimento permite que os laboratórios processem eficientemente grandes conjuntos de amostras, ao mesmo tempo que minimizam o trabalho e a variabilidade.

1. Placas de Múltiplos Poços e Limpeza com Esferas Magnéticas

A transição de protocolos de tubo ou de spin individuais para formatos de placa de 96 poços aumenta drasticamente a capacidade de processamento.

Por exemplo, o kit DNeasy® 96 PowerSoil® Pro QIAcube® HT forneceu consistentemente altos rendimentos e pureza em diversos tipos de solo em menos de 3 horas por placa, incluindo a extração e a preparação da biblioteca, permitindo fluxos de trabalho de sequenciação de alto rendimento a preços acessíveis.

A limpeza com esferas magnéticas em formatos de 96 e até 384 poços oferece uma purificação precisa e escalável com risco mínimo de contaminação cruzada.

2. Automação Robótica de Manipulação de Líquidos

Plataformas como Hamilton STAR, Opentrons OT-2 e Promega Maxwell suportam a extração de DNA em 96 poços, reduzindo drasticamente o tempo de manuseio e aumentando a reprodutibilidade.

Um estudo utilizando um sistema Hamilton STAR processou 96 amostras de sangue total de forma automática e fiável em uma única corrida.

Um sistema baseado em Hamilton capaz de isolar 1.600 amostras de DNA plasmídico em formato de 96 poços ao longo de 12 horas demonstra um potencial de elevado rendimento.

3. Extração Integrada e Preparação de Biblioteca

Os avançados sistemas robóticos agora permitem que a extração de DNA e a preparação de bibliotecas sejam realizadas sequencialmente no mesmo equipamento. Estações de trabalho NGS funcionais como a Opentrons Flex podem executar a extração e a preparação de bibliotecas em paralelo, aumentando a eficiência.

4. Eficiência de Tempo e Trabalho

Sistemas automatizados de limpeza baseados em esferas (por exemplo, compatíveis com AMPure XP) podem processar centenas de amostras por dia, reduzindo erros de pipetagem e fornecendo DNA consistente e de alta pureza.

Ao miniaturizar protocolos, os custos consumíveis por amostra podem cair para apenas alguns dólares (por exemplo, preparação de bibliotecas reduzida para cerca de 7 dólares por amostra), tornando o sequenciamento de alto rendimento financeiramente viável.

Conclusão:

A escalabilidade do laboratório depende da transição de preparação manual para protocolos baseados em placas, melhorados por robôs de manuseio de líquidos e limpeza baseada em esferas. Com plataformas modernas, os laboratórios podem processar de centenas a milhares de amostras por semana, com controlo de qualidade consistente e tempo de intervenção manual mínimo, acelerando dramaticamente os prazos dos projetos de NGS.

Ferramentas, Modelos e Recursos

Para capacitar os laboratórios na implementação de fluxos de trabalho de extração rápida de ADN em grande escala, considere incorporar as seguintes ferramentas e recursos prontos a usar:

• Lista de Verificação de SOP

Uma lista de verificação detalhada de SOP pode orientar cada etapa da extração—homogeneização, lise, ligação de esferas, lavagens, QC e eluição. Por exemplo, o SOP do nPOD descreve protocolos passo a passo para a extração de tecidos utilizando kits DNeasy da Qiagen, listando os tampões e os tempos essenciais.

• Modelo de QC (Formato de Folha de Cálculo)

Crie uma folha de rastreamento para ID da amostra, concentração Qubit, A260/280, métricas de tamanho de fragmento (por exemplo, TapeStation) e status de aprovação/reprovação. Muitos laboratórios inspiram-se nos templates de QC documentados do PulseNet utilizados para validação de extratos em fluxos de trabalho de WGS.

• Fluxograma de Árvore de Decisão

Utilize fluxogramas para orientar as escolhas de extração com base no tipo de amostra, na plataforma subsequente e nas necessidades de rendimento. Por exemplo, os estudos da PLOS One apresentam diagramas de fluxo que detalham etapas sobrepostas que reduzem o tempo de manuseio para 48 amostras em menos de 50 minutos por lote.

• Exemplos de Protocólos de Extração Rápida

Aceda a métodos rápidos comprovados por pesquisa (por exemplo, para tecidos microbianos ou de plantas) testados quanto à qualidade e eficiência. Um estudo sobre tecidos de carvalho (Quercus) apresentou um método indireto baseado em SDS e coluna de centrifugação que fornece DNA metagenómico de alta pureza num curto espaço de tempo.

• Guias da Plataforma Automatizada

Aproveite os cartões de arranque rápido ou de protocolo fornecidos pelos fornecedores, como a série Qiagen EZ1/2. Estes incluem scripts padrão otimizados para uma configuração simplificada do instrumento—ideais para laboratórios que estão a fazer a transição de fluxos de trabalho manuais para automatizados.

Como Utilizar Estes Recursos:

• Descarregar e PersonalizarAdapte os modelos para o seu laboratório com base nos tipos de amostras, metas de rendimento e instrumentação.
• Implementar Controles de QCAtribua tipos de amostras adequados como controlos de extração e integre pontos de controlo de QC desde cedo.
• Piloto e AperfeiçoarRealize um teste em pequena escala (8–16 amostras) utilizando o protocolo guiado por fluxograma, e depois analise os resultados de QC para otimizar o volume de esferas, a duração das lavagens ou os scripts de automação.

Estas ferramentas não só facilitam a implementação rápida, mas também apoiam a rastreabilidade e a escalabilidade—aspectos fundamentais para laboratórios que pretendem implementar fluxos de trabalho NGS acelerados com confiança.

Resumo

A implementação de um fluxo de trabalho de extração de DNA em regime acelerado apresenta uma oportunidade convincente para acelerar os prazos de NGS e manter uma saída de dados de alta qualidade:

• Velocidade e Eficiência: Desde a homogeneização da amostra até ao DNA pronto para a biblioteca pode ser concluído em menos de 45 minutos para pequenos lotes e em menos de 90 minutos para placas de 96 poços completas quando automatizado.
• Rendimento Escalável: A transição para sistemas de extração baseados em placas e centrados em esferas, juntamente com a integração de robôs de manuseio de líquidos, suporta o processamento de centenas a milhares de amostras semanalmente—enquanto controla custos e mão-de-obra.
• Qualidade de Dados Mantida: Quando os protocolos incluem etapas de limpeza direcionadas e controlo de qualidade em linha, fluxos de trabalho rápidos produzem ADN que corresponde aos métodos tradicionais em pureza e desempenho em aplicações de sequenciação de leituras curtas e direcionadas.

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Referências:

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