Controlo de Qualidade da Biblioteca de Sequenciação ATAC

ATAC-seq (Assay para a Análise de Cromatina Acessível com Sequenciação de Alto Rendimento) é uma técnica poderosa que aproveita as propriedades de transposição da enzima Tn5 para investigar a cromatina aberta, a impressão de fatores de transcrição e a localização de nucleossomas. No entanto, devido ao tempo e custo consideráveis envolvidos na sequenciação, os investigadores e as empresas de sequenciação frequentemente realizam verificações de qualidade pré-sequenciação nas bibliotecas construídas. Estas verificações abrangem vários parâmetros, como a concentração da biblioteca e o tamanho dos fragmentos, para garantir resultados fiáveis e significativos.

Leitura Recomendada: ATAC-Seq – Um Método para Estudar a Cromatina Aberta.

Comparado a outras bibliotecas de sequenciamento, ATAC-seq As bibliotecas apresentam desafios únicos em termos de avaliação de qualidade. A incerteza surge de potenciais variações entre tipos de amostras e pré-tratamentos, que podem impactar significativamente a qualidade das bibliotecas geradas.

As bibliotecas ATAC-seq são tipicamente preparadas a partir de núcleos ou células intactas, onde o transposão penetra na membrana nuclear ou celular para acessar o interior da cromatina. A reação de transposição incorpora, então, sequências de junção de sequenciamento no DNA fragmentado. No entanto, a acessibilidade da cromatina pode ser influenciada por vários fatores, incluindo tipo celular, número de células, atividade celular, agrupamento celular e a concentração relativa do transposão em relação ao DNA. Como resultado, o número e o tamanho dos fragmentos da biblioteca podem apresentar uma variabilidade considerável.

Perfil típico de TapeStation (TapeStation D1000 neste caso) de uma biblioteca ATAC-seq. (Maor-Nof et al., 2021)

Para enfrentar estes desafios e garantir dados fiáveis, medidas abrangentes de controlo de qualidade são indispensáveis. Os investigadores avaliam meticulosamente a concentração da biblioteca e a distribuição do tamanho dos fragmentos para otimizar os esforços de sequenciação. Além disso, compreender as características específicas de cada amostra e ter em conta as variações potenciais pode ajudar na interpretação precisa dos dados resultantes.

Análise do Tamanho dos Fragmentos para Bibliotecas ATAC-Seq

Para uma avaliação abrangente das bibliotecas ATAC-Seq, é essencial analisar a distribuição dos fragmentos de DNA após a amplificação da biblioteca. Recomendamos vivamente a utilização de um analisador de fragmentos de DNA para realizar esta tarefa. Ao gerar um eletroferograma dos fragmentos, os investigadores podem obter informações valiosas sobre os tamanhos dos fragmentos e as suas formas de pico. Para garantir resultados precisos, é aconselhável utilizar um ensaio com uma resolução inferior a 1000 pares de bases (pb).

A análise do tamanho dos fragmentos fornece informações críticas sobre a integridade e eficiência da biblioteca. Um pico bem definido e concentrado no eletroferograma indica uma distribuição homogénea de fragmentos de DNA dentro da faixa desejada. Por outro lado, formas de pico irregulares ou distribuições de tamanho amplas podem indicar potenciais problemas com a preparação ou amplificação da biblioteca.

Ao realizar esta análise, os investigadores podem avaliar com confiança o sucesso do Preparação de biblioteca ATAC-Seq e tomar decisões informadas sobre a estratégia de sequenciação. Em última análise, este passo contribui significativamente para a fiabilidade e qualidade dos dados gerados, levando a interpretações mais precisas da acessibilidade da cromatina e do mapeamento de elementos regulatórios.

Controlo de Qualidade das Bibliotecas ATAC-Seq

A unidade fundamental da cromatina eucariótica é o nucleossoma, que compreende 147 pares de bases (pb) de DNA envoltos em um octâmero de histonas, ligados por ligadores de DNA de 20-90 pb. A compactação da cromatina, determinada pela sua interação com as histonas, desempenha um papel crucial na regulação da expressão génica.

Em regiões de cromatina aberta, onde o DNA interage fracamente com as histonas, os promotores e potenciadores de transcrição podem ligar-se facilmente ao DNA, facilitando a transcrição. Por outro lado, em regiões de cromatina fechada com uma ligação apertada entre o DNA e as histonas, os fatores de transcrição têm dificuldade em aceder às regiões de promotores e potenciadores, inibindo a transcrição.

O ATAC-Seq aproveita a capacidade da enzima Tn5 modificada de aceder a regiões de cromatina aberta, cortando o DNA em fragmentos enquanto adiciona as sequências de adaptador necessárias para sequenciação. O processo de transposição pode ocorrer em várias regiões de junção entre nucleossomas, resultando em fragmentos curtos (<90 bp) ou fragmentos maiores com nucleossomas intercalados entre o DNA cortado pela Tn5.

Após a amplificação da biblioteca e a adição de índices Illumina, os fragmentos da biblioteca variam tipicamente entre aproximadamente 200 bp e 1000 bp. Picos entre 160-200 bp aparecem devido à periodicidade dos nucleossomas vizinhos.

O tamanho e a forma dos fragmentos da biblioteca ATAC-Seq podem variar significativamente entre amostras devido a diferenças nos tipos celulares, estado de atividade, número de células e processamento das amostras. Esta variabilidade depende de características específicas das células e da proporção de transposões em relação ao DNA.

A variação nos picos de nucleossomas é influenciada pela frequência de clivagem do DNA pelo Tn5, mas o número ou tamanho dos picos nem sempre correlaciona diretamente com a qualidade dos dados de sequenciação. As formas dos picos da biblioteca muitas vezes assemelham-se a uma pista de esqui em vez de exibirem picos distintos.

No entanto, o fator mais crítico para as bibliotecas é apresentar uma boa distribuição de fragmentos na faixa de 200-1000 bp, de preferência abaixo de 600 bp. Esta característica garante a captura de informações essenciais sobre a acessibilidade da cromatina e melhora a fiabilidade dos dados de ATAC-Seq.

Otimização da Reação de Transposição para Preparação Eficiente de Bibliotecas ATAC-Seq

A reação de transposição é um passo crítico na preparação da biblioteca ATAC-Seq que envolve a adição da enzima Tn5 para aceder à cromatina e clivar o DNA em fragmentos. No entanto, uma quantidade insuficiente de Tn5 ou uma baixa razão Tn5-DNA pode levar a uma transposição inadequada, resultando em sub-tagmentação. Este fenómeno é caracterizado por fragmentos de DNA maiores concentrados em torno de 800bp.

Fragmentos grandes apresentam várias desvantagens, como um agrupamento ineficiente nas células de fluxo, levando a uma menor densidade de agrupamento e a uma redução na produção de sequências. Para alcançar a cobertura desejada, é necessário mais sequenciamento para fragmentos maiores em comparação com os menores.

A subtagamentação pode resultar de vários fatores, sendo a preparação inadequada do núcleo uma causa comum. Obter núcleos bem separados e suspensos a partir de amostras de tecido é mais desafiador do que a partir de células cultivadas, tornando a subtagamentação mais prevalente em amostras de tecido.

Para abordar questões de subtagamento, as seguintes sugestões podem ser úteis:

• Assegure uma resuspensão completa em tampão de lise e homogeneize as amostras de tecido para uma preparação ótima do núcleo.
• Aumente o tempo de lise celular em gelo para melhorar a atividade do Tn5.
• Aumentar o tempo de reação da transposase para promover uma clivagem eficiente.
• Adicione uma lavagem extra com PBS antes da lise para eliminar potenciais inibidores da lise na amostra.

Outra causa de fragmentos de ADN em excesso pode ser a má qualidade da amostra, particularmente quando células mortas libertam quantidades excessivas de ADN aberto na suspensão celular. Este ADN em excesso pode saturar a atividade do Tn5, reduzindo a sua ligação ao ADN da cromatina.

Para evitar este problema, recomenda-se utilizar células frescas com alta atividade ou células congeladas numa solução de 50% FBS, 40% meio de cultura e 10% DMSO. Para amostras de tecido, o congelamento rápido em azoto líquido e o armazenamento a -80℃ são essenciais para preservar a qualidade da amostra. Os experimentos devem ser realizados rapidamente, e o tecido não deve ser deixado a descongelar antes de ser picado numa placa de Petri sobre gelo.

Nos casos em que são utilizadas células classificadas por FACS, deve-se ter cautela para minimizar danos celulares durante o processo de classificação. Empregue técnicas de classificação otimizadas para reduzir danos e procure começar com o maior número possível de células. Além disso, classificar populações celulares raras com menos de 10% de ocupação pode causar mais danos do que classificar células com alta ocupação (por exemplo, 70%).

Além das precauções mencionadas, a manipulação experimental precisa e a atenção ao detalhe durante o processo experimental são essenciais para minimizar erros entre amostras.

Rendimentos de Biblioteca de ATAC-Seq

Ao começar com 50.000-100.000 células frescas, pode-se alcançar uma produção ideal de 400-600 ng. Este rendimento é obtido num volume final de eluição de 20 μL, com uma concentração de aproximadamente 20-30 ng/μL.

No entanto, é importante notar que as células selecionadas por FACS podem produzir quantidades inferiores de DNA devido a danos celulares durante o processo de seleção. Além disso, se for a primeira vez que se tenta o experimento ATAC-Seq, a falta de familiaridade com os passos pode levar à perda de DNA durante as operações experimentais.

Para minimizar a perda de amostras, especialmente ao trabalhar com esferas magnéticas SPRI, uma abordagem suave é fundamental. O etanol deve ser adicionado suavemente ao fundo do tubo, permitindo que suba lentamente sem perturbar as esferas magnéticas. Deve-se evitar a secagem excessiva das esferas, pois isso pode causar a quebra das esferas e uma perda significativa de amostra. Durante a purificação de DNA em coluna, adicionar o tampão de eluição ao centro da coluna garante uma recuperação eficiente do DNA.

Para experiências de ATAC-Seq, são necessárias quantidades relativamente pequenas de DNA para sequenciação. Portanto, embora o rendimento seja importante, não é necessário focar excessivamente nele. Desde que haja DNA suficiente para sequenciação e os fragmentos da biblioteca pareçam satisfatórios, as bibliotecas podem avançar para a sequenciação.

Variabilidade na Biblioteca ATAC-Seq

É comum observar diferenças nas formas dos picos entre os fragmentos da biblioteca ATAC-Seq de várias amostras experimentais e até mesmo entre diferentes lotes do processo de preparação da biblioteca. Estas variações podem surgir devido a fatores como o número de células utilizadas, condições de lise celular ou outras diferenças subtis que influenciam a frequência de clivagem do Tn5 ou pA-Tn5.

Apesar de tais variações na frequência de clivagem e das diferenças resultantes na aparência dos fragmentos da biblioteca, a qualidade dos dados de sequenciação pode permanecer estável e fiável entre estas amostras. Esta estabilidade deve-se principalmente ao facto de que os picos de dados são em grande parte governados pela acessibilidade do Tn5 ao cromatina aberta ou do pA-Tn5 a anticorpos.

Embora a aparência das formas de pico da biblioteca possa servir como um indicador qualitativo para decidir se deve prosseguir com o sequenciamento, é essencial entender que a qualidade da biblioteca por si só não garante o sucesso do sequenciamento. No entanto, os resultados do controlo de qualidade (CQ) da biblioteca podem fornecer informações valiosas sobre a probabilidade de sucesso do sequenciamento e oferecer oportunidades para a otimização do processo com base nos resultados do CQ.

Para garantir uma quantificação precisa da biblioteca, devem ser utilizados ensaios baseados em qPCR. Este passo aumenta ainda mais a confiança na adequação da biblioteca para sequenciação e facilita decisões informadas no fluxo de trabalho de sequenciação.

Em conclusão, compreender a variabilidade nos picos de fragmentos da biblioteca ATAC-Seq é crucial para interpretar os resultados de sequenciação de forma eficaz. Embora a aparência dos picos possa orientar o processo de tomada de decisão, uma QC abrangente da biblioteca, juntamente com a quantificação baseada em qPCR, contribui para a execução bem-sucedida dos experimentos ATAC-Seq e para a geração de insights epigenéticos significativos.

Referência:

1. Beck, Daniel, Millissia Ben Maamar, e Michael K. Skinner. "Comparações de métodos de análise de densidade de CpG em todo o genoma e metilação de DNA (MeDIP, RRBS e WGBS)." Epigenética 17,5 (2022): 518-530.