Sequenciação de Polissomas e Integração Multi-Ómica: Ligando a Tradução com a Transcritoscopia e a Proteómica

Sequenciação de polissomas (Polysome-seq) é a técnica padrão de referência para estudar a eficiência da tradução. Ela separa os mRNAs de tradução ativa ligados a ≥2 ribossomas através da centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Ao contrário do Ribo-seq (que captura fragmentos protegidos por ribossomas, RPFs), Polisoma-seq foca em mRNAs ligados a polissomos, avaliando diretamente a atividade tradutória e a capacidade tradutória de RNAs não codificantes.

Principais características do Polysome-seq:

• Quantificação da eficiência de tradução: O índice de polirribossoma (PS) é calculado com base na razão entre o mRNA ligado a polirribossomas e o mRNA total, refletindo a atividade translacional.

• Monitorização dinâmica: Captura o bloqueio de ribossomas, eventos de colisão e alterações na tradução induzidas por stress (por exemplo, o stress oxidativo aumenta a proporção de mRNAs monossomais).

• Deteção de RNA não codificante: Detecta a tradução de regiões atípicas (por exemplo, lncRNA/circRNA) através da ligação do ribossoma.

Exemplo de Perfilagem de Polissomos (Ye Y et al., 2021)

Estrutura de Integração Multi-ômica

Para conectar a transcrição, a tradução e as camadas regulatórias pós-traducionais, o Polysome-seq precisa ser integrado com RNA-seq (transcriptómica) e proteómica (como LC-MS/MS ou DIA-MS) para construir um pipeline de análise de biologia de sistemas e elucidar gargalos na expressão génica e redes regulatórias.

Estratégias de Integração

• Padronização de Dados:
  • RNA-seq: Fornece informações sobre a abundância de transcritos e splicing alternativo.
  • Polysome-seq: Quantifica a eficiência de tradução (ET = mRNA polirribossomal / mRNA total).
  • Proteómica: Mede a abundância de proteínas e as modificações pós-traducionais (PTMs).

Métodos Analíticos Chave

• Análise de Correlação: Compara os níveis de mRNA do RNA-seq com a abundância de proteínas da proteómica para identificar a regulação pós-transcricional.

• Redes de Co-expressão: Correlaciona os valores de TE do Polysome-seq com dados de RNA-seq e proteómica para mapear vias altamente ativas na tradução (como respostas ao stress).

• Modelagem de equações estruturais (SEM): Quantificação das contribuições da regulação transcricional e translacional à expressão proteica.

Estratégia de Integração Multi-ómica

Análise Combinada com Transcriptoma

Wu J et al. isolouaram mRNAs ligados a ribossomas (não-polissoma, polissoma leve e polissoma pesada) usando perfilamento de polissomasCombinado com a análise de RNA-seq, descobriram que a inibição da EPRS (por exemplo, utilizando o inibidor específico PRS HF) reduziu significativamente a proporção de genes ricos em prolina (PRRs, como colagénio, LTBP2 e SULF1) em polissomas pesados (alta atividade translacional), demonstrando que a eficiência da sua tradução é regulada pela EPRS.

Identificaram-se oitenta e três genes PRR (Tabela IX/X online). Estes genes estão regulados em baixa pela HF a nível pós-transcricional e constituem uma parte importante da MEC e de moléculas de sinalização secretórias, tornando-os alvos-chave para a fibrose miocárdica.

A análise integrada de polysome-seq e RNA-seq mostrou que EPRS, ao regular a eficiência de tradução dos genes PRR (como colagénio, LTBP2 e SULF1), torna-se um fator chave na fibrose cardíaca, fornecendo uma base para terapias anti-fibróticas que visam EPRS ou os seus efetores a jusante (como SULF1).

Os genes pró-ricos são alvos de tradução preferenciais da EPRS (Wu J et al., 2020)

Wang Z et al., utilizando análise de multiméricos (centrifugação em gradiente de sacarose para separar multiméricos) combinada com RNA-seq, descobriram que o mutante ospus1-1 (perda da função de OsPUS1) apresentou o seguinte a baixas temperaturas:

• Montagem anormal de ribossomas de cloroplastos (perfil de multimero mostrando defeitos nos ribossomas) e atividade translacional diminuída (proporção reduzida de múltiplos multiméros);

• rRNA maduro reduzido, rRNA precursor acumulado e biossíntese de ribossomas inibida.

A análise de RNA-seq e de expressão diferencial (edgeR) mostrou que no mutante ospus1-1, a expressão de genes relacionados com a fotossíntese foi downregulada (inibição do crescimento), enquanto a expressão de genes de resposta ao stress foi upregulada (induzida pela acumulação de ROS);

A deteção de ROS revelou uma acumulação severa de espécies reativas de oxigénio (ROS) no mutante a baixas temperaturas, perturbando a homeostase celular e perturbando ainda mais a rede de expressão génica (através da regulação da sinalização retrógrada de genes nucleares). A sequenciação SeqHB-LMPCR confirmou a ligação de OsPUS1 ao rRNA precursor de cloroplasto (pre-rRNA);

A RT-qPCR quantitativa validou genes diferencialmente expressos (como genes de stress);

A análise de ontologia genética (TBtools) revelou que OsPUS1 regula vias como a biossíntese de ribossomas e a tradução.

A integração do sequenciamento de polissomos e das tecnologias multi-ômicas mostrou que a OsPUS1, ao mediar a modificação Ψ do rRNA do cloroplasto, mantém a função do ribossoma e a eficiência da tradução, equilibrando o crescimento e a resposta ao estresse, sendo um regulador chave da adaptação do arroz a baixas temperaturas. Esta descoberta fornece um novo alvo para melhorar a tolerância ao frio das culturas (como regular a expressão da OsPUS1 ou a modificação do rRNA).

A homeostase do transcriptoma e do translatoma é afetada nos mutantes de arroz ospus1-1 a baixas temperaturas (Wang Z et al., 2022)

(2) Associação Proteómica

Li Q et al., através da análise de multiméricos (centrifugação em gradiente de sacarose para separar o mRNA ligado a ribossomas), combinada com qRT-PCR e proteómica, descobriram que: quando YTHDF1 foi superexpresso, o mRNA de ATG2A/ATG14 foi enriquecido em multiméricos (alta atividade translacional), e a eficiência de tradução aumentou significativamente; após a redução/removal de YTHDF1, a eficiência de tradução de ATG2A/ATG14 diminuiu, e a expressão da proteína relacionada com a autofagia (LC3) diminuiu.

Ensaios ChIP e ensaios de reporter de luciferase dual confirmaram que, em condições hipoxicas, HIF-1α liga-se diretamente ao promotor do YTHDF1, ativando a sua transcrição (YTHDF1 é altamente expresso em tecidos de HCC e está associado a um mau prognóstico).

MeRIP-seq e Descanse em paz mostrou que YTHDF1 aumenta a estabilidade e a tradução do mRNA de ATG2A/ATG14 ao reconhecer o local de modificação m6A (a análise da estabilidade do RNA mostrou que a meia-vida do mRNA de ATG2A/ATG14 foi encurtada após a redução de YTHDF1). A sequenciação de polissomos e a integração multi-óptica indicam que YTHDF1 é um regulador chave da autofagia induzida por hipoxia no HCC. Ele ativa ATG2A/ATG14 através da tradução dependente de m6A, promovendo a progressão maligna. YTHDF1 pode servir como um biomarcador prognóstico e alvo terapêutico para HCC (por exemplo, inibindo YTHDF1 ou seus genes de autofagia a jusante).

MeRIP-seq e proteómica identificaram potenciais alvos de YTHDF1 em HCC (Li Q et al., 2021)

Bhaduri U et al., utilizando sequenciação de polissomos e RNA-seq, descobriram que o silenciamento do TRIM8 resultou em:

• regulação significativa em alta do lncRNA MALAT1 ligado a multisomas (MALAT1 interage com miR-561 para regular TOP2A, e a sua redução induz paragem em G0/G1);

• atividade de tradução alterada, afetando a eficiência de tradução de genes de autofagia como ATG2A/ATG14 (as alterações na expressão proteica foram verificadas por LC-MS/MS).

A análise de scRNA-seq e de expressão diferencial mostrou que a depleção de TRIM8 perturba a via de "regulação do ciclo celular de replicação cromossómica", afetando a expressão génica nas fases G0/G1/S/G2/M (como as proteínas TOP2A e do complexo MCM);

A citometria de fluxo (BrdU/7-AAD) confirmou que o silenciamento do TRIM8 levou a uma heterogeneidade do ciclo celular e acumulação na fase G0/G1 (consistente com a paragem induzida pela regulação em alta do MALAT1). A proteómica LC-MS/MS identificou proteínas expressas de forma diferencial reguladas pelo TRIM8 (como CEP170 e componentes do complexo MCM), enriquecidas na via do centrosoma/fuso.

RT-qPCR+ChIP validou ainda mais a regulação transcricional/traducional do TRIM8 sobre genes-alvo (como MALAT1 e TOP2A), e ensaios de cicatrização de feridas mostraram que o TRIM8 influencia a migração celular.

A sequenciação de polissomos e a integração de multi-ópticas revelaram que o TRIM8 atua como um regulador chave de múltiplas etapas da mitose (replicação do centrómero-replicação do cromossoma-citoquinese) ao regular a eficiência de tradução de RNAs que se ligam a polissomos (como o MALAT1), mantendo a expressão de genes do ciclo celular (TOP2A/MCM) e a montagem de cílios primários, fornecendo uma base para a terapia do câncer (como a mira no eixo regulador mitótico TRIM8).

Estudo de proteómica diferencial (LC-MS/MS) e translatómica (perfilagem de polissomos com RNA-seq) após silenciamento do TRIM8 em células RPE (Bhaduri U et al., 2025)

(3) Integração com o Grupo de Modificadores Epigenéticos

Chen Z et al., através da sequenciação de mRNA associado a múltiplos ribossomas (TE = FPKM de mRNA de múltiplos ribossomas / FPKM de RNA total) combinada com qPCR, descobriram que:

• Após a redução da expressão de METTL1/WDR4, a proporção de mRNAs alvo (como genes que contêm códons relacionados com m7G) diminuiu em multi-ribossomas (alta atividade translacional), e a eficiência de tradução foi significativamente reduzida;

• A superexpressão da METTL1 de tipo selvagem (mutante de morte não catalítica) aumentou a eficiência de tradução dos mRNAs alvo e promoveu a progressão do HCC.

Quantificação de modificação de tRNA por LC-MS: Após a redução da expressão de METTL1, a percentagem de modificação m7G do tRNA diminuiu (por exemplo, redução da modificação m7G no tRNA-LysCTT);

A TRAC-seq (sequenciação de redução e clivagem de m7G de tRNA) identificou locais de modificação m7G (por exemplo, posições 46-48 em tRNA-LysCTT), e o enriquecimento de tRNAs modificados por m7G foi verificado por imunoprecipitação anti-m7G seguida de qPCR.

Integração multi-ômica: A análise de dados do TCGA mostrou que o METTL1/WDR4 está altamente expresso em HCC e está associado a estágios avançados e baixa sobrevivência; RNA-seq/proteómica validou alterações na expressão de genes-alvo (como genes relacionados com proliferação e migração).

A sequenciação de polissomos e a integração de multi-ópticas indicam que o METTL1/WDR4 aumenta a eficiência de tradução de mRNAs contendo códons preferenciais de m7G ao catalisar a modificação do tRNA m7G, impulsionando o fenótipo maligno do HCC e fornecendo uma base para a terapia do HCC direcionada à modificação do tRNA m7G.

METTL1 regula o metiloma de tRNA m7G, a expressão de tRNA e a tradução global de mRNA (Chen Z et al., 2021)

Lu X et al., através de perfis multisomais (combinados com qRT-PCR), descobriram que: quando YTHDF1 foi superexpresso, o mRNA SLC7A11 foi enriquecido em complexos multisomais (alta atividade translacional), e a eficiência de tradução aumentou significativamente; após a redução de YTHDF1, a eficiência de tradução de SLC7A11 diminuiu, a expressão da proteína anti-ferroptose GPX4 diminuiu e os níveis de ferroptose aumentaram.

O ensaio de reporter de dupla luciferase e o ChIP-PCR confirmaram que, em condições hipoxicas, a HIF-1α liga-se diretamente ao promotor do YTHDF1, ativando a sua transcrição (o YTHDF1 é altamente expresso nas NPCs e está associado à anti-ferroptose).

Ensaios RIP mostrou que YTHDF1 reconhece o local de modificação m6A do mRNA SLC7A11 (previsto pelo SRAMP) através do seu domínio YTH, aumentando a estabilidade e a tradução do mRNA.

Os ensaios de estabilidade do RNA (tratamento com actinomicina D) indicaram que a redução da expressão de YTHDF1 encurtou a meia-vida do mRNA SLC7A11 (degradação acelerada).

Ensaios de estabilidade de proteínas (tratamento com CHX) mostraram que YTHDF1 promove a acumulação da proteína SLC7A11 (a tradução aumentada compensa a degradação).

A sequenciação de polissomos e a integração de multi-ópticas revelaram que o YTHDF1 é um regulador translacional chave a jusante do HIF-1α, ativando o SLC7A11 através da tradução dependente de m6A e mantendo a via anti-ferroptose sistémica Xc⁻-GSH-GPX4, proporcionando um novo alvo para a terapia da IVDD (como a regulação do eixo HIF-1α-YTHDF1-SLC7A11).

YTHDF1 promove a tradução do mRNA SLC7A11 ao ligar-se a ele (Lu X et al., 2024)

Desafios e Direções Futuras

• Limitações Técnicas:

• A Polysome-seq depende de um grande número de células (≥1×10⁷), limitando a sua aplicação em amostras raras.

• Sequenciação de leitura curta (como Ribo-seq) é suscetível ao viés de distribuição dos ribossomas, necessitando da combinação com técnicas de leitura longa para analisar ORFs complexos.

• Direcções da Fronteira:

• Tradução Espacial: Combinando técnicas de transcriptómica espacial para analisar a heterogeneidade translacional no microambiente tecidual.

• Integração de Inteligência Artificial: Utilização de aprendizagem profunda para prever redes regulatórias de tradução, como modelos de fusão de multi-ómicas baseados em GNNs.

Resumo

A sequenciação de polissomas e a integração de multi-ómicas fornecem uma perspetiva panorâmica para a análise da regulação da tradução, demonstrando fortes capacidades analíticas desde os mecanismos moleculares (como a modificação de RNA e a dinâmica dos ribossomas) até aos processos fisiológicos e patológicos (como a resposta ao stress e a tumorigénese). Esforços futuros precisam de ultrapassar gargalos tecnológicos e aprofundar o desenvolvimento de algoritmos de cross-ómica para revelar plenamente a complexidade da regulação da tradução.

As Pessoas Também Perguntam

Como integrar dados multi-ómicos?

A integração de dados multi-ómicos envolve tipicamente o uso de métodos computacionais para combinar e analisar dados de diferentes camadas moleculares (por exemplo, genómica, transcriptómica, proteómica) para descobrir insights biológicos abrangentes.

Quais são os conceitos de genómica, transcriptómica, proteómica e metabolómica?

A genómica estuda o conjunto completo de ADN num organismo, a transcriptómica analisa todas as moléculas de RNA, a proteómica examina o conjunto total de proteínas e a metabolómica foca-se no perfil abrangente de metabolitos de pequenas moléculas.

Qual é a diferença entre transcriptómica e proteómica?

A transcriptómica estuda o conjunto completo de transcritos de RNA para avaliar a expressão génica, enquanto a proteómica foca no complemento total de proteínas para determinar a sua abundância, modificações e funções.

Quais são os desafios da integração de dados multi-ômicos?

No entanto, a integração de dados multi-ómicos apresenta desafios significativos devido à alta dimensionalidade, heterogeneidade, lacunas experimentais e frequência de valores em falta entre os tipos de dados.

O que é a integração multi-ômica?

A integração de dados multi-ómicos é um termo que se refere ao processo de combinar e analisar dados de diferentes fontes experimentais ómicas, como genómica, transcriptómica, ensaios de metilação e sequenciação de microRNA, entre outros.

Referências

1. Wu J, Subbaiah KCV, Xie LH, Jiang F, Khor ES, Mickelsen D, Myers JR, Tang WHW, Yao P. A Glutamil-Prolil-tRNA Sintetase Regula a Síntese de Proteínas Pro-Fibróticas Ricas em Prolina Durante a Fibrose Cardíaca. Circ Res. 2020 28 de agosto;127(6):827-846.
2. Wang Z, Sun J, Zu X, Gong J, Deng H, Hang R, Zhang X, Liu C, Deng X, Luo L, Wei X, Song X, Cao X. A pseudouridilação do RNA ribossómico dos cloroplastos contribui para a aclimatação a baixas temperaturas no arroz.. Novo Phytol. 2022 Dez;236(5):1708-1720.
3. Li Q, Ni Y, Zhang L, Jiang R, Xu J, Yang H, Hu Y, Qiu J, Pu L, Tang J, Wang X. A expressão induzida por HIF-1α do leitor de m6A YTHDF1 impulsiona a autofagia induzida por hipoxia e a malignidade do carcinoma hepatocelular ao promover a tradução de ATG2A e ATG14.. Signal Transduct Target Ther. 2021 Fev 23;6(1):76.
4. Bhaduri U, Di Venere E, Squeo GM, Gemma G, Tamiro F, Avolio R, Senatore E, Salvemini L, Di Paola R, Licastro D, Iacobucci I, Tretola V, Salerno P, Feliciello A, Monti M, Giambra V, Merla G. O papel dinâmico da TRIM8, uma nova proteína ciliar, durante várias fases da mitose.. Doença da Morte Celular. 2025, 7 de outubro; 16(1):707.
5. Chen Z, Zhu W, Zhu S, Sun K, Liao J, Liu H, Dai Z, Han H, Ren X, Yang Q, Zheng S, Peng B, Peng S, Kuang M, Lin S. METTL1 promove a hepatocarcinogénese através de m⁷Controlo da tradução dependente da modificação do tRNA G. Clin Transl Med. 2021 Dez;11(12):e661.
6. Lu X, Li D, Lin Z, Gao T, Gong Z, Zhang Y, Wang H, Xia X, Lu F, Song J, Xu G, Jiang J, Ma X, Zou F. A expressão induzida por HIF-1α do leitor de m6A YTHDF1 inibe a ferroptose das células do núcleo pulposo ao promover a tradução de SLC7A11.. Célula Envelhecida. 2024 Set;23(9):e14210.
7. Kozlova A, Sarygina E, Ilgisonis E, Tarbeeva S, Ponomarenko E. O Mapa do Translatoma: RNC-Seq vs. Ribo-Seq para Perfilagem das Linhagens Celulares HBE, A549 e MCF-7. Int J Mol Sci. 2024, 12 de outubro; 25(20):10970.