Fluxo de Trabalho de Sequenciação de miRNA: Uma Visão Abrangente

os miARNs é fundamental para a regulação da expressão génica pós-transcricional, orquestrando diversos processos celulares essenciais para o desenvolvimento do organismo, a homeostase e a patogénese de doenças. O advento de sequenciação de nova geração A (NGS) revolucionou a investigação de miRNA, oferecendo insights sem precedentes sobre o complexo panorama da expressão de pequenos RNAs. Um conhecimento abrangente das suas funções regulatórias e padrões de expressão é fundamental para decifrar os seus respetivos papéis na saúde e em estados patológicos. O sequenciamento de miRNA, uma técnica formidável, facilita um perfil detalhado da expressão de miRNA, lançando assim luz sobre as suas implicações funcionais. Neste discurso, apresentamos uma visão detalhada do fluxo de trabalho e protocolo de sequenciamento de miRNA, sublinhando cada passo constitutivo do processo.

Como Funciona o Sequenciamento de miRNA

1. Preparação de Amostras

O processo de sequenciação de miRNA começa com a preparação da amostra, na qual o RNA de alta qualidade é extraído dos espécimes biológicos pertinentes. Diversas fontes de amostra, que vão desde tecidos, células, biofluidos até amostras ambientais, são adequadas para a análise de sequenciação de miRNA. As metodologias de extração para RNA total são escolhidas criteriosamente para garantir a preservação das espécies de RNA pequeno, com técnicas comumente utilizadas incluindo a extração por TRIzol ou kits de purificação baseados em coluna. Uma atenção rigorosa é dedicada a mitigar os riscos de degradação e contaminação do RNA ao longo das fases de manuseio e processamento.

2. Controlo de Qualidade do RNA

Após a extração de RNA, a qualidade e a quantidade do RNA extraído são avaliadas utilizando métodos espectrofotométricos, como a absorção UV, e técnicas eletroforéticas como a eletroforese em gel de agarose. Manter a integridade do RNA é fundamental para o sucesso do sequenciamento de miRNA, uma vez que o RNA degradado pode comprometer a precisão e a robustez dos resultados do sequenciamento. Consequentemente, critérios rigorosos são aplicados para selecionar espécimes de RNA de alta qualidade com frações de RNA pequeno preservadas para a construção subsequente da biblioteca.

3. Preparação da Biblioteca de RNA Pequeno

O próximo passo no sequenciação de miRNA O fluxo de trabalho é a geração de bibliotecas de pequenos RNAs. Moléculas de pequenos RNAs, incluindo miARNs, são enriquecidas a partir do pool total de RNAs utilizando métodos de seleção por tamanho, como eletroforese em gel ou cromatografia de exclusão por tamanho. A fração de pequenos RNAs enriquecida é então ligada a adaptadores que facilitam a transcrição reversa e a amplificação. Esta etapa introduz códigos de barras ou índices únicos a amostras individuais, permitindo o sequenciamento multiplexado de várias amostras em uma única corrida de sequenciamento.

4. Transcrição Reversa e Amplificação por PCR

Após a ligadura, um primer específico para miRNA é utilizado para converter os pequenos RNAs aderidos aos adaptadores em DNAs complementares (cDNAs). Neste ponto, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) é utilizada para acentuar a biblioteca de cDNA e integrar os conjuntos necessários para o sequenciamento posterior. A otimização meticulosa das condições de PCR é fundamental para minimizar o viés e reduzir a probabilidade de artefatos durante a amplificação, garantindo assim o alinhamento da abundância de miRNA na biblioteca de sequenciamento final com a amostra original.

5. Controlo de Qualidade da Biblioteca

Após a amplificação por PCR, a qualidade e a quantidade das bibliotecas de RNA pequeno são avaliadas utilizando metodologias analíticas como a eletroforese capilar (por exemplo, Agilent Bioanalyzer) ou técnicas fluorométricas (por exemplo, fluorómetro Qubit). A avaliação da distribuição do tamanho da biblioteca e da concentração é imperativa para assegurar a conformidade com os critérios de sequenciação. Subsequentemente, as bibliotecas que cumprem com os padrões de controlo de qualidade passam por normalização e agrupamento em preparação para a sequenciação.

6. Sequenciação

As bibliotecas de pequenos RNAs combinadas são introduzidas numa plataforma de sequenciação de nova geração, como Illumina MiSeq, HiSeq ou NovaSeq, para passar por sequenciação por síntese. Ao longo deste processo, nucleotídeos marcados com fluorescência são sucessivamente incorporados em cadeias de ADN complementares, resultando em leituras de sequência que retratam fielmente a composição de pequenos RNAs da amostra. A profundidade de sequenciação, quantificada pelo número de leituras geradas por amostra, é ajustada para atender à cobertura e sensibilidade desejadas necessárias para uma análise precisa da expressão de miRNA.

7. Pré-processamento de Dados e Controlo de Qualidade

Após a sequenciação, os dados brutos produzidos pelo sequenciador passam por pré-processamento para eliminar sequências de adaptadores, leituras de baixa qualidade e artefatos de sequenciação. Parâmetros de controlo de qualidade, como a qualidade da sequência por base e a distribuição do conteúdo de GC, são analisados para manter a integridade dos dados. Os procedimentos de pré-processamento podem ainda envolver a excisão de bases de baixa qualidade e a seleção de leituras de acordo com critérios de comprimento e composição da sequência.

8. Alinhamento e Mapeamento

As leituras de sequenciamento pré-processadas são alinhadas a genomas de referência ou bases de dados de sequências de miRNA utilizando algoritmos de alinhamento especializados, como Bowtie, BWA ou miRDeep2. Em casos onde as espécies possuem genomas bem anotados, as leituras podem ser mapeadas diretamente para coordenadas genómicas correspondentes a miRNAs estabelecidos. Por outro lado, quando genomas de referência estão ausentes ou incompletos, as leituras podem ser alinhadas a bases de dados de sequências de miRNA para identificar miRNAs conhecidos ou empregar metodologias de predição de miRNA de novo.

9. Quantificação da Expressão de miRNA

Ao mapear as leituras, os níveis de expressão das miARNs são quantificados contando o número de leituras que se alinham a cada sequência de miARN. Para mitigar discrepâncias decorrentes de variações na profundidade de sequenciamento e no tamanho da biblioteca entre amostras, são empregadas técnicas de normalização, como leituras por milhão (RPM) ou transcritos por milhão (TPM). Os perfis de expressão de miARN resultantes fornecem informações quantitativas sobre a abundância de miARNs individuais nas amostras.

10. Análise de Expressão Diferencial

Metodologias estatísticas são empregues para discernir miARNs diferencialmente expressos em diferentes condições experimentais ou coortes de amostras. A análise de expressão diferencial envolve uma avaliação comparativa dos níveis de expressão de miARN entre amostras, considerando meticulosamente fatores como réplicas biológicas e nuances do desenho experimental. MiARNs significativamente desregulados são identificados através de critérios estatísticos rigorosos que abrangem a mudança em dobro e valores de p ajustados, elucidando assim as alterações regulatórias mediadas por miARNs ligadas a processos biológicos ou condições patológicas.

11. Anotação Funcional e Análise de Vias

A expressão diferencial de miARNs exige um exame rigoroso para desvendar o seu significado funcional dentro de estruturas biológicas, abrangendo vias celulares e etiologias de doenças. Esta exploração requer uma abordagem multifacetada, integrando perfis de expressão de miARN com recursos e bases de dados de bioinformática de ponta. Através desta integração, realizamos análises de enriquecimento de vias, prevemos candidatos a genes-alvo e delineamos redes regulatórias moduladas por padrões de expressão aberrante de miARN. Ao aprofundarmo-nos na anotação funcional e nas análises de vias, obtemos percepções profundas sobre os papéis fundamentais das alterações na expressão de miARN, desvendando assim o seu envolvimento intrincado na fisiopatologia das doenças.

12. Validação e Validação Experimental

Em conclusão, após a identificação de candidatos a miRNA através de análises de sequenciação, segue-se uma rigorosa validação através de metodologias experimentais como a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR), blotting de Northern ou ensaios funcionais. Estes procedimentos de validação servem para corroborar os perfis de expressão e os impactos regulatórios dos candidatos a miRNA identificados, solidificando assim os resultados derivados das análises de sequenciação de miRNA. Esta validação experimental é um pilar fundamental, essencial para afirmar a credibilidade e a importância biológica dos resultados da sequenciação de miRNA, ao mesmo tempo que fornece valiosas elucidações funcionais sobre o envolvimento dos miRNAs em distintos contextos biológicos.

13. Interpretação de Dados e Insights Biológicos

Os resultados derivados da análise de sequenciação de miRNA, em conjunto com dados de validação experimental, passam por uma interpretação meticulosa com o objetivo de elucidar as complexas funções regulatórias dos miRNAs tanto no bem-estar fisiológico como em estados patológicos. Através de uma abordagem integrativa, na qual os perfis de expressão de miRNA são harmonizados com diversos conjuntos de dados ómicos que abrangem a expressão de mRNA, proteómica e epigenómica, alcança-se uma compreensão holística das redes regulatórias impulsionadas por miRNA, iluminando a sua profunda influência na dinâmica celular e nas manifestações da doença. Este esforço interpretativo não só promove a geração de hipóteses e incita a formulação de questões de investigação pertinentes, mas também revela potenciais alvos terapêuticos que merecem uma exploração e escrutínio adicionais.

Fluxo de trabalho de sequenciação de miRNA e análise de dados.

Protocolo de Sequenciação de miRNA

Nesta continuação do fluxo de trabalho de sequenciação de miRNA, iremos aprofundar o protocolo que detalha os passos envolvidos na preparação da biblioteca de miRNA, sequenciação e análise de dados.

Protocolo de Preparação de Biblioteca de miRNA

Materiais:

Amostras de RNA total

Kit de preparação de biblioteca de RNA pequeno (por exemplo, Conjunto de Preparação de Biblioteca de Pequenos RNAs para Illumina)

Água livre de nucleases

Adaptadores e primers

Inibidor de RNase

Transcriptase reversa

reagentes de PCR (por exemplo, Taq polimerase, dNTPs, tampões de PCR)

Procedimento:

Ligação de Adaptadores: Misture amostras de RNA com adaptadores de RNA 3' e 5' e tampão de ligase. Incube a mistura a uma temperatura apropriada para a ligação dos adaptadores.

Transcrição Reversa: Adicione transcriptase reversa e inibidor de RNase às amostras de RNA ligadas para gerar cDNA. Incube a mistura de reação a uma temperatura apropriada para a transcrição reversa.

Amplificação por PCR: Amplifique cDNA utilizando primers de PCR que se ligam aos adaptadores. Realize a PCR em condições otimizadas para amplificar a biblioteca de RNA pequeno. Incorpore sequências de código de barras para multiplexação, se desejado.

Limpeza da Biblioteca: Purificar bibliotecas amplificadas utilizando métodos de seleção de tamanho (por exemplo, eletroforese em gel ou purificação baseada em esferas magnéticas) para remover adaptadores não incorporados e dimers de primers.

Controlo de Qualidade da Biblioteca: Avaliar a qualidade e a quantidade da biblioteca utilizando técnicas analíticas como eletroforese capilar ou quantificação fluorométrica. Validar a distribuição do tamanho da biblioteca e a concentração antes da junção para sequenciação.

Protocolo de Sequenciação

Materiais:

Bibliotecas de RNA pequeno

Plataforma de sequenciação (por exemplo, Illumina MiSeq, HiSeq ou NovaSeq)

Reagentes de sequenciação (por exemplo, células de fluxo, primers de sequenciação e tampões)

Reagentes de indexação para sequenciação multiplexada

Procedimento:

Desnaturação da Biblioteca: Desnaturar bibliotecas de RNA pequeno para gerar templados de DNA de cadeia simples para a geração de clusters de sequenciação.

Geração de Clusters: Imobilizar bibliotecas desnaturadas na superfície do chip de sequenciação utilizando amplificação em ponte para gerar clusters de fragmentos de DNA idênticos.

Sequenciação por Síntese: Realizar a sequenciação por síntese utilizando nucleotídeos marcados com fluorescência para gerar leituras de sequência a partir dos clusters de DNA. Monitorizar os sinais de fluorescência para determinar a sequência dos nucleotídeos incorporados.

Chamadas de Bases: Converter sinais de fluorescência em chamadas de bases de nucleotídeos utilizando o software de sequenciamento fornecido pela plataforma de sequenciamento.

Geração de Dados: Colete dados de sequenciamento brutos, incluindo leituras de sequência e pontuações de qualidade, do sequenciador para análise posterior.

Protocolo de Análise de Dados

Pipeline de Bioinformática:

Pré-processamento: Remover sequências de adaptadores e bases de baixa qualidade das leituras de sequenciamento brutas. Filtrar leituras curtas (< 15 nucleotídeos) e sequências com baixa complexidade.

Alinhamento: Mapear leituras processadas a genomas de referência ou bases de dados de sequências de miRNA utilizando algoritmos de alinhamento (por exemplo, Bowtie ou BWA).

Quantificação: Conte o número de leituras que se alinham a cada sequência de miRNA. Normalize as contagens de leituras para corrigir as diferenças na profundidade de sequenciação e no tamanho da biblioteca.

Análise de Expressão Diferencial: Identificar miRNAs expressos diferencialmente entre condições experimentais utilizando métodos estatísticos (por exemplo, DESeq2 ou edgeR).

Anotação Funcional: Anotar funcionalmente os miARNs com base na previsão de genes-alvo, análise de enriquecimento de vias e análise de redes regulatórias.

Validação: Validar os resultados de sequenciação utilizando técnicas experimentais como qRT-PCR ou ensaios funcionais para confirmar os padrões de expressão e os efeitos regulatórios dos miARNs candidatos.

Conclusão

O fluxo de trabalho de sequenciação de miRNA fornece uma estrutura robusta para o perfilamento da expressão de miRNA e para a elucidação do seu significado funcional em processos biológicos e doenças. Ao seguir o protocolo descrito acima, os investigadores podem gerar dados de sequenciação de miRNA de alta qualidade, analisar padrões de expressão diferencial e obter insights sobre redes regulatórias mediadas por miRNA. Esta abordagem abrangente facilita a descoberta de novos biomarcadores, alvos terapêuticos e insights mecanicistas sobre a biologia do miRNA, contribuindo para avanços na investigação biomédica e na medicina de precisão.

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