Como Estudar Melhoradores através de Sequenciação?

Para desvendar os segredos dos potenciadores, os cientistas utilizam técnicas de sequenciação avançadas. Métodos de sequenciação, como ChIP-seq (Imunoprecipitação de Cromatina com Sequenciação) e Hi-C (Captura de Conformação de Cromossomas de Alto Rendimento), permitem que os investigadores mapeiem com precisão as localizações dos potenciadores, identifiquem genes-alvo e compreendam os seus intrincados mecanismos regulatórios.

O que é um potenciador?

Os potenciadores são sequências notáveis não codificantes que residem no genoma e detêm a chave para controlar a expressão génica ao ativar genes-alvo transcritos pela RNA polimerase II (RNAPII). Estes elementos essenciais estão predominantemente localizados em regiões intergénicas e intrónicas, com alguns até encontrados dentro de exões. Neste artigo, exploramos as características dos potenciadores e as metodologias utilizadas para os estudar através de técnicas de sequenciação.

Potenciadores Genómicos. (Carullo et al., 2019)

• Regulação Remota
  Um dos aspectos mais fascinantes dos potenciadores é a sua natureza remota. Tipicamente situados a montante do gene-alvo a cerca de -200 pares de bases, os potenciadores podem aumentar a transcrição de promotores distantes. Podem até ativar a expressão de genes-alvo localizados até um milhão de pares de bases de distância. Um exemplo claro disso é a relação regulatória entre o gene Shh do rato e a sua sequência potenciadora ZRS. A ZRS, situada dentro do 5º íntron do gene Lmbr1, encontra-se a um milhão de pares de bases de Shh. A ZRS orquestra a expressão de Shh formando uma estrutura de laço, uma ilustração clássica da funcionalidade dos potenciadores.
• Impacto Não Direcional
  Os potenciadores exibem uma notável não direcionalidade no seu papel como potenciadores transcricionais. Eles podem modular eficazmente a expressão génica, estejam localizados a montante, a jusante ou dentro do próprio gene alvo. Por exemplo, um potenciador que controla a expressão específica do gene de Arabidopsis. SUPRESSOR LATERAL (LAS) está situado 3,2 quilobases a jusante do quadro de leitura aberto LAS, enquanto o bloco de potenciador C do LOCUS DE FLORAÇÃO T (FT) o gene está posicionado aproximadamente 5 quilobases a montante do gene.
• Atividade Específica do Tecido
  Os potenciadores exibem níveis de atividade distintos em vários tipos de células ou tecidos. Esta especificidade é ditada por fatores proteicos específicos de células ou tecidos. Por exemplo, os potenciadores dos genes de imunoglobulina apresentam atividade máxima exclusivamente em linfócitos B. Nas células β do pâncreas, um fator proteico específico pode ativar o potenciador do gene da insulina humana, promovendo a transcrição do gene da insulina. Este fator está ausente em outros tipos de células, tornando a expressão do gene da insulina principalmente confinada às células β do pâncreas.
• Propriedades Fásicas
  A funcionalidade dos potenciadores está intrinsecamente ligada à conformação do DNA. A conformação dinâmica do DNA é fundamental para a sua capacidade de regular a expressão génica em resposta a vários estímulos.
• Influência de Espécies Heterólogas
  Notavelmente, alguns potenciadores podem impactar a expressão genética entre espécies. Ratos que possuem potenciadores HARE5 humanos exibem características cerebrais únicas encontradas exclusivamente em cérebros humanos, com o tamanho do cérebro a mostrar um aumento de 12% em comparação com embriões de rato que possuem potenciadores HARE5 de chimpanzé. Esta influência entre espécies destaca a versatilidade dos potenciadores na condução de características específicas de cada espécie.
• Responsividade a Sinais Externos
  Certos potenciadores são conhecidos por serem ativados por sinais externos. Por exemplo, hormonas esteroides podem ativar potenciadores específicos, e o potenciador do gene de choque térmico entra em ação a altas temperaturas, levando à expressão do gene.

Estudo de Melhoradores através de Sequenciação

• Motivos de Fatores de Transcrição
  Os potenciadores estão enriquecidos com uma variedade diversificada de motivos de fatores de transcrição (TF). Estes motivos são sequências de DNA específicas que determinam a ligação dos TFs, desencadeando a ativação do potenciador. Em várias espécies, os motivos de TF foram meticulosamente previstos através de técnicas avançadas como ChIP-seq (Sequenciação de Imunoprecipitação de Cromatina) ou DAP-seq (Sequenciação por Purificação de Afinidade de DNA). Por exemplo, o DAP-seq revelou com sucesso 529 motivos de TF em Arabidopsis thaliana, contornando a necessidade de anticorpos específicos para TF de plantas que exigem muito trabalho e evitando os desafios impostos pelos baixos níveis de expressão de TF. Ao contrário do ChIP-seq, que normalmente requer a construção de plasmídeos de superexpressão para proteínas-alvo marcadas, DAP-seq destaca-se como uma abordagem in vitro, eliminando a necessidade de anticorpos específicos e tornando-a adequada para espécies de plantas sem sistemas de transformação.

Pipeline computacional e método para selecionar os melhores PWMs de um TF a partir de experiências individuais e o melhor PWM entre múltiplas experiências. (Yu et al., 2021)

• Acessibilidade da Cromatina
  A acessibilidade da cromatina, definida pela ocupação de nucleossomas e interações de proteínas associadas à cromatina, influencia profundamente a ligação de fatores de transcrição (TF) a sequências regulatórias. Elementos cis-regulatórios ativos, como promotores e potenciadores, são predominantemente encontrados em regiões genómicas abertas conhecidas como regiões deficientes em nucleossomas (NDRs). As NDRs foram amplamente mapeadas em uma escala genómica em espécies como Arabidopsis thalianamilho e arroz. Um método inovador chamado ATAC-seq (Teste para Cromatina Acessível a Transposase com sequenciação de alto débito) surgiu como uma alternativa prática às técnicas convencionais, como MNase-seq, FAIRE-seq e DNase-seq. O ATAC-seq apresenta inúmeras vantagens, incluindo a sua simplicidade, tempo experimental reduzido e requisitos mínimos de amostra, destacando-se em relação aos seus homólogos.
  Por favor, leia o artigo. ATAC-Seq – Um Método para Estudar a Cromatina Aberta.

Prevê potenciadores a partir de amostras clínicas de ATAC-seq. (Thibodeau et al., 2018)

• Modificações de Histonas
  as modificações de histonas desempenham um papel fundamental na regulação da expressão genética e na acessibilidade da cromatina. Nas regiões de potenciadores, os nucleossomas apresentam modificações específicas de histonas que refletem o seu estado regulador. Enquanto os animais têm marcadores de histonas bem caracterizados, como H3K4me1 para potenciadores, H3K9ac, H4K12ac, H3K14ac e H3K27ac para potenciadores ativos, e H3K27me3 para potenciadores inativos, as plantas estão gradualmente a desvendar as suas próprias complexidades. Potenciadores ativos em plantas, como os da ervilha (PetE) e do milho (b1), são enriquecidos em H3/H4ac e H3K9/K14ac, respetivamente. Além disso, as NDRs intergénicas no arroz exibem correlações com H4K12ac e H3K27me3. A investigação em Arabidopsis destacou uma forte ligação entre potenciadores inativos e H3K27me3 e uma correlação ainda mais pronunciada entre potenciadores ativos e H3K27ac. Isto implica que os potenciadores ativos em plantas apresentam frequentemente acetilação de H3 e H4, enquanto os potenciadores inativos estão associados a H3K27me3. Para explorar estas modificações de histonas em uma escala genómica, ChIP-seq permanece um método amplamente utilizado.
  Por favor, leia o artigo. Como Analisar Dados de ChIP-Seq: Desde o Pré-processamento de Dados até a Análise Posterior.
• Metilação do DNA
  A metilação do DNA desempenha um papel fundamental na regulação transcricional tanto em animais como em plantas. Quando um potenciador apresenta metilação do DNA, pode exercer uma influência de regulação negativa na expressão de genes-alvo. Exemplos notáveis incluem a metilação do DNA nos genes do milho. cor do pericarpo 1 (p1) e b1, e os genes de Arabidopsis FLORIDA WAGENINGEN (FWA), MUITAS BOCAS (TMB)e FT em sequências regulatórias, todas as quais atuam como supressores da expressão génica. Em humanos e em ratos, os níveis de metilação do DNA dentro de potenciadores são regulados de forma dinâmica e exibem uma correlação negativa com a atividade dos potenciadores. Isso permite a distinção de potenciadores específicos de tecido. No âmbito da biologia vegetal, tornou-se evidente que a metilação do DNA de elementos cis-regulatórios é gerida de forma dinâmica, adicionando uma camada de complexidade aos mecanismos regulatórios das plantas.
  Por favor, leia o artigo. Identificação de DMC, DMR e DMG na Análise de Metilação do DNA.
  

  A metilação anómala do ADN nas regiões de potenciadores desregula o programa transcricional das neoplasias mieloides. (Ordoñez et al., 2019)

  
  Níveis baixos de metilação do DNA frequentemente servem como um indicador de potenciadores ativos. A avaliação dos níveis de metilação do DNA em todo o genoma pode ser realizada de forma eficaz através da técnica de Sequenciação por Bisulfito (BS-seq)Na BS-seq, o DNA é tratado com bisulfito, um processo que converte os resíduos de citosina (C) em uracilo (U). No entanto, os resíduos de 5-metilcitosina (5mC) permanecem resistentes a esta transformação. Consequentemente, o DNA submetido ao tratamento com bisulfito retém apenas a citosina metilada. Seguindo este princípio, o DNA genómico é convertido por bisulfito, utilizado para construir bibliotecas e sujeito a sequenciação de alto rendimento. O resultado é a capacidade de discernir padrões de metilação em todo o genoma com uma resolução de base única, analisando as transições C-T nas leituras sequenciadas. A BS-seq foi originalmente pioneira em Arabidopsis e desde então encontrou aplicação em várias outras espécies de plantas.
• Interacções da Cromatina
  As interacções da cromatina são um aspecto crítico da organização do genoma, influenciando a regulação genética. Técnicas como a Captura da Conformação dos Cromossomas (3C) e os seus derivados (por exemplo, 4C, 5C, Hi-C, ChIA-PET, etc.) oferecem informações valiosas sobre estas interacções em várias regiões genómicas. O conceito fundamental por detrás da técnica 3C envolve a ligação cruzada da cromatina com formaldeído para preservar a estrutura tridimensional da cromatina. Subsequentemente, a cromatina é clivada utilizando uma endonuclease de restrição (como HindIII, BglII, SacI, BamH ou EcoRI). Esta clivagem resulta na separação do ADN interagente dos genes não interagentes em torno das proteínas. Estas interacções levam à formação de dois tipos de laços: aqueles entre os mesmos genes e aqueles envolvendo genes recíprocos. A distinção entre estes dois tipos de laços é alcançada através da análise por PCR.

Ao empregar técnicas como 3C e os seus derivados, os investigadores obtêm informações valiosas sobre a organização espacial da cromatina e as interações dinâmicas entre genes, proporcionando uma compreensão mais profunda de como os genes são regulados no contexto da sua estrutura tridimensional de cromatina.

Referências:

1. Carullo, Nancy VN, e Jeremy J. Day. "Aumentadores genómicos na saúde e doença do cérebro." Genes 10.1 (2019): 43.
2. Yu, Chun-Ping, et al. "Descobrindo locais de ligação de fatores de transcrição humanos e de rato desconhecidos e as suas características a partir de dados de ChIP-seq." Atas da Academia Nacional de Ciências 118,20 (2021): e2026754118.
3. Thibodeau, Asa, et al. "Um modelo baseado em rede neural prevê eficazmente os potenciadores a partir de amostras clínicas de ATAC-seq." Relatórios científicos 8.1 (2018): 16048.
4. Ordoñez, Raquel, et al. "Metilação de DNA de elementos de potenciadores em neoplasmas mieloides: pensar fora dos promotores?." Cancros 11.10 (2019): 1424.