Mapeamento de Ligação Genética: Definição, Técnicas e Aplicações

Introdução ao Ligação Genética e Mapa de Ligação

As sequências de DNA que estão próximas umas das outras em um cromossoma tendem a ser transmitidas juntas durante a fase de meiose da reprodução sexual. Quando dois marcadores genéticos estão fisicamente próximos, é menos provável que sejam separados em diferentes cromátides durante o cruzamento cromossómico e, assim, diz-se que estão mais ligados do que os marcadores que estão distantes. Em outras palavras, quanto mais próximos dois genes estão em um cromossoma, menos provável é que se recombinem, e mais provável é que sejam herdados juntos. Diferentes marcadores cromossómicos são completamente não relacionados.

A mapa de ligação genética descreve a posição dos genes ou marcadores genéticos conhecidos de uma espécie ou população experimental em termos de frequência de recombinação, em vez de uma distância física particular ao longo de cada cromossoma. Um mapa de ligação é um gráfico que mostra com que frequência os marcadores se recombinam durante a troca de cromossomas homólogos. Quanto mais recombinação (segregação) ocorre entre dois marcadores genéticos, mais distantes se pensa que estão. Por outro lado, quanto menor a distância física entre os marcadores, menor a frequência de recombinação entre eles. Anteriormente, fenótipos distinguíveis (produção de enzimas, cor dos olhos) derivados de sequências de ADN codificantes eram usados como marcadores; eventualmente, sequências de ADN não codificantes, como microssatélites ou aqueles que geram polimorfismos de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs) foram utilizados.

Os investigadores podem usar mapas de ligação para encontrar outros marcadores, como genes, testando a ligação genética entre marcadores previamente identificados. Os dados são utilizados para montar grupos de ligação, que são grupos de genes que se sabe estarem ligados, nas fases iniciais de desenvolvimento de um mapa de ligação. Mais marcadores podem ser incorporados a um grupo à medida que o conhecimento avança, até que o grupo abranja um cromossoma inteiro.

Frequência de recombinação

A frequência de recombinação serve como um métrico para a ligação genética, utilizada na criação de mapas de ligação genética. Genes que não estão completamente ligados sofrem invariavelmente recombinação devido à troca de segmentos cromossómicos homólogos durante a meiose. Isso leva à geração de recombinantes ou progenitores caracterizados por uma nova combinação de traços. Esses recombinantes constituem uma certa proporção do total de progenitores, representada como um valor de recombinação, percentagem de recombinação ou frequência de recombinação.

Esta medida, expressa como a percentagem de recombinantes na prole total, descreve a probabilidade de eventos de recombinação entre marcadores genéticos ligados. Tal referência pode também ser denominada centimorgan (cM), a unidade que ilustra uma frequência de recombinação de 1%.

Esta informação de recombinação fornece um meio indireto, mas poderoso, de quantificar a distância genética entre dois loci. Ao examinar a sua frequência de recombinação, os cientistas podem fazer inferências sobre as suas posições relativas no cromossoma, contribuindo para a nossa compreensão das arquiteturas genómicas e das dinâmicas evolutivas.

Fatores que Influenciam a Frequência de Recominação: Distância e Posição dos Genes, Taxa de Transmissão e Viabilidade dos Gametas, Variações Estruturais Cromossómicas, Níveis Hormonais, Temperatura e Radiação, Concentração de Iões, Fatores externos como idade, entre outros.

Pontos-chave:

• Os genes localizados em cromossomos diferentes ou a distâncias consideráveis no mesmo cromossomo, assortem-se independentemente uns dos outros e são considerados não ligados.
• Quando os genes estão próximos uns dos outros no mesmo cromossoma, diz-se que estão ligados, indicando que alelos ou variantes genéticas já presentes num cromossoma têm maior probabilidade de serem herdados juntos como uma unidade.
• Ao utilizar os dados obtidos a partir do cruzamento genético para calcular as frequências de recombinação, podemos obter informações sobre se dois genes estão relacionados e determinar a intensidade da sua ligação.
• Ao examinar as frequências de recombinação de numerosos pares de genes, podemos construir um mapa de ligação que revela a ordem e as distâncias relativas dos genes em um cromossoma.

Figura 1. (a) Mapas de ligação física e (b, c) mapas de ligação genética. (Chao, 2015)

Diferença entre Mapa Genético e Mapa Físico

Um mapa genético de uma espécie retrata as posições relativas de genes conhecidos e/ou marcadores genéticos no cromossomo, não as suas localizações físicas únicas em cada cromossomo. Usando métodos de análise genética, como experiências de hibridização e análise de linhagens familiares, os genes ou outros marcadores de DNA são ordenados no cromossomo. A distância entre os marcadores, ou a distância do mapa genético, é representada pela frequência de eventos de recombinação durante a meiose, sendo medida em centimorgans (cM), com cada unidade a definir uma taxa de troca de 1%. A resolução de um mapa genético é algo grosseira, alcançando aproximadamente um nível de um milhão de pares de bases (1Mb).

Um mapa físico, na essência, mostra a localização física de marcadores identificáveis (como locais de corte de enzimas de restrição ou genes) no DNA. A distância do mapa é a unidade de comprimento físico, como a banda do cromossoma ou o número de pares de nucleotídeos.

Comparação dos dois:

• Um mapa genético é baseado em frequências de recombinação, enquanto um mapa físico é baseado em características estruturais do DNA medidas diretamente.
• A frequência de recombinação meiótica é desigual ao longo da maioria dos cromossomas, com áreas de recombinação e/ou mutação de hotspot e coldspot.
• Um mapa genético indica a distância relativa entre genes ou marcadores, representada pelo valor de recombinação e medida em cM.
• Um mapa físico destaca a distância física entre genes ou marcadores, a unidade de distância é uma unidade de comprimento, como micrómetros (μm) ou números de pares de bases (bp ou kp).

Técnicas Utilizadas no Mapeamento de Ligação Genética

A tecnologia de mapeamento de ligação genética abrange principalmente duas facetas: a deteção e análise de marcadores genéticos, seguida pela construção e delineação de mapas de ligação. Em termos de deteção de marcadores genéticos, técnicas biológicas modernas, como a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e tecnologias de sequenciação, oferecem abordagens de alto rendimento e alta resolução; estas podem identificar rapidamente e com precisão uma multitude de marcadores genéticos. Por outro lado, ao construir correlações de ligação, as técnicas prevalentes incluem a análise de ligação genética e a análise de correlação genótipo-fenótipo.

Tecnologias Baseadas em Marcadores Moleculares:

Marcadores moleculares podem ser categorizados em quatro tipos de acordo com as suas características técnicas: técnicas de marcadores de DNA baseadas na hibridação molecular, como Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP); técnicas de marcadores de DNA baseadas em PCR, como Repetições de Sequência Simples (SSR); técnicas de marcadores de DNA que combinam PCR com corte por enzimas de restrição, como Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos Ampliificados (AFLP); e técnicas de marcadores de DNA ancoradas em Polimorfismos de Nucleotídeo Único (SNP).

RFLP: A RFLP identifica polimorfismos de DNA ao cortar o DNA com endonucleases de restrição e, posteriormente, detectar fragmentos de DNA de diferentes comprimentos através de métodos como a eletroforese em gel.

AFLP: AFLP integra o uso de endonucleases de restrição e PCR para detectar de forma eficiente fragmentos polimórficos dentro do DNA e é frequentemente utilizado na análise de ligação genética e no mapeamento genético.

SSR ou Microssatélite Marcadores: SSR consiste em unidades repetidas de DNA de sequência curta. A sua variação de comprimento é útil para a análise de ligação genética. Microssatélite Os marcadores, por outro lado, baseiam-se na amplificação por PCR e nas técnicas de eletroforese em gel para detectar polimorfismos em regiões de SSR.

SNPs: Os SNPs podem ser detetados por PCR, sequenciação, etc., e são amplamente aplicados na análise de ligação genética e em estudos de associação genómica.

Tecnologias que Aproveitam o Sequenciamento de Alto Débito:

Genotipagem por sequenciação (GBS)A GBS utiliza tecnologia de sequenciação de alto rendimento para sequenciar genomas e realizar análises de ligação genética, observando as variações na sequência de DNA em cada indivíduo. Esta técnica é adequada para análises de genótipos em larga escala e para a criação de mapas genéticos.

Sequenciação do Genoma Completo (WGS) para Mapeamento de LigaçãoAo sequenciar todo o genoma, o WGS pode identificar com precisão as localizações cromossómicas de marcadores genéticos, proporcionando uma abordagem de alta resolução para o mapeamento de ligação genética.

Métodos Computacionais Avançados para Análises de Mapeamento de Ligação:

Software e Algoritmos de Mapeamento Genético: Isto inclui principalmente software como JoinMap, MapMaker e algoritmos, incluindo análise LOD e métodos de Máxima Verossimilhança.

Integração do Mapeamento de Ligação com Estudos de Associação Genómica: Combinar o mapeamento de ligação com GWAS pode discernir de forma mais precisa as relações entre genes e fenótipos, e identificar novas variantes genéticas relacionadas a fenótipos específicos.

Aplicações do Mapeamento de Ligação Genética

Posicionamento e Identificação de Genes e Locais de Características Quantitativas (QTL): Ao analisar as relações de ligação genética, é possível determinar as localizações cromossómicas dos genes que influenciam características específicas, permitindo a sua posicionamento e identificação. Isto revela pistas e ferramentas essenciais para compreender a base genética de várias características nos organismos. Entre as metodologias de investigação clássicas está o mapeamento de QTL, um processo que identifica os genes relacionados com as características-alvo com base na relação de ligação entre marcadores moleculares e as características-alvo. O mapeamento genético é tipicamente utilizado para análises locacionais das variações de forma entre dois progenitores com características marcadamente diferentes e populações de descendência com múltiplas características fenotípicas.

Figura 2. Mapeamento de QTL em múltiplos ambientes. (Fang et al., 2020)

Criação Assistida por Marcadores: Através da análise de marcadores genéticos relacionados às características-alvo, os criadores podem escolher de forma mais precisa indivíduos com as características desejadas para a reprodução, aumentando assim a eficiência e a rapidez da seleção. Esta técnica permite que os criadores prevejam e selecionem indivíduos com características desejáveis sem a necessidade de extensos ensaios laboratoriais ou de campo, apresentando uma estratégia eficaz para a melhoria da qualidade e do rendimento das culturas. Com base na construção de um mapa de ligação genética, pode-se realizar um posicionamento genético adicional através da seminação de marcadores e identificação de fenótipos, obtendo assim o gene-alvo. Isso estabelece uma base sólida para o posterior clonagem de genes e suas aplicações na reprodução.

O mapeamento genético de plantas é amplamente aplicado na pesquisa em genómica, melhoria de variedades e posicionamento de genes. Oferece uma ferramenta importante para entender a estrutura e as propriedades genéticas dos genomas das plantas, fornecendo orientações valiosas para os investigadores explorarem a base genética das características das plantas e realizarem melhoramento molecular. Bernard et al. utilizaram técnicas como o mapeamento de ligação genética para investigar a estrutura genética de características fenológicas e de frutificação lateral na nogueira persa (Juglans regia L.). As suas descobertas aprimoraram a nossa compreensão da arquitetura genética subjacente a características agronómicas importantes associadas aos processos de floração masculina e feminina da nogueira, bem como à frutificação lateral. Os resultados sublinharam a importância da data de germinação como uma das características mais cruciais para resultados desejáveis, sugerindo que novos marcadores ajudariam na seleção e desenvolvimento de variedades de nogueira adequadas a climas específicos.

Mapeamento Comparativo e Estudos Evolutivos: Ao comparar os mapas de ligação genética de diferentes espécies ou populações, podem ser reveladas as suas relações genéticas, histórias evolutivas e estruturas populacionais. Isto ajuda os investigadores a compreender a origem, evolução e processos evolutivos adaptativos das espécies, oferecendo pistas importantes na proteção da biodiversidade e na exploração dos mecanismos da biologia evolutiva.

Figura 3. Chamada de SNP e construção de mapeamento genético. (Fang et al., 2020)

Identificação de Variantes Genéticas Associadas a Doenças em Humanos e Organismos Modelo: Ao analisar mapas de ligação genética, é possível determinar a posição cromossómica de variantes genéticas associadas a doenças e estudar mais a fundo a sua influência no início e desenvolvimento da doença. Isso fornece uma base importante para o diagnóstico precoce de doenças, avaliação de risco e tratamento, tendo implicações significativas para a saúde humana e a prevenção e controlo de doenças. Julier et al. realizaram uma investigação sobre o mapa genético do cromossoma humano 22, elucidando a localização do polimorfismo P1 do grupo sanguíneo P no cromossoma 22 (proximal ao locus do oncogene SIS), fornecendo assim evidências adicionais.

Referências:

1. Chao S, Elias E, Benscher D, et al. Mapeamento genético de loci de traços quantitativos de dormência de sementes de efeito maior no cromossoma 2B usando linhas de substituição recombinante em trigo tetraploide. Ciência das Culturas. Jan 2016;56(1).
2. Fay D. Mapeamento genético e manipulação: Capítulo 1 - Introdução e fundamentos. WormBook2006 Fev 17;17.
3. Jeffreys A J, Neumann R. Fatores que influenciam a frequência e distribuição de recombinação em um hotspot de crossover meiótico humano. Genética molecular humana, 2005, 14(15): 2277-2287.
4. Julier C, Lathrop G M, Reghis A, et al. Um mapa de ligação e físico do cromossoma 22, e algumas aplicações ao mapeamento de genes. Revista Americana de Genética Humana, 1988, 42(2): 297.
5. Bernard A, Marrano A, Donkpegan A, et al. Mapeamento de associação e ligação para desvendar a arquitetura genética de características fenológicas e de frutificação lateral na nogueira persa (Juglans regia L.). BMC Genomics, 2020, 21: 1-25.
6. Fang Y, Zhang X, Zhang X, et al. Um mapa de ligação genética de alta densidade de SLAFs e análise de QTL do tamanho e peso dos grãos na cevada (Hordeum vulgare L.). Fronteiras em Ciência das Plantas, 2020, 11: 620922.