Análise Genómica Funcional de Patógenos Vegetais: Desde Perspectivas Mecanísticas até Gestão e Controlo de Doenças

Ao integrar PacBio/Nanopore, multiómicas e Edição genética CRISPR tecnologia, A genómica funcional de patógenos de plantas analisa sistematicamente o mecanismo patogénico e a rede de interação hospedeiro de fungos, oomicetos e outros patógenos. Foi descoberto que os patógenos visam e interferem com as vias imunes das plantas através de estratégias evolutivas adaptativas, como a expressão específica espaço-temporal de proteínas efetoras e a transferência horizontal de genes. O silenciamento gênico induzido pelo hospedeiro (HIGS) e a edição direcionada de genes causadores de doenças oferecem novos meios para intervenções precisas. Para enfrentar o desafio da complexidade genómica, a transcriptómica espacial e o aprendizado de máquina melhoraram significativamente a precisão de integração de dados multi-ômicos, revelando as mudanças dinâmicas dos clusters de genes de metabolismo secundário e outras características patogénicas chave. A nível de aplicação, a seleção para resistência a doenças com base no mecanismo de interação entre proteínas efetoras e NLR e o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas direcionados a genes causadores de doenças estão a promover a inovação de variedades de culturas de alta resistência e pesticidas verdes. No futuro, a integração interdisciplinar e os modelos de previsão da evolução de patógenos irão otimizar a rede de monitorização de doenças, fornecendo suporte teórico e técnico para a construção de um sistema inteligente de prevenção e controlo e garantindo a segurança alimentar.

Introdução aos patógenos de plantas e genómica funcional

Classificação e perigos dos patógenos das plantas

Os patógenos das plantas incluem principalmente fungos, oomicetos, bactérias, vírus e nematóides. Os seus mecanismos de infecção são diversos, representando uma séria ameaça à agricultura global. Patógenos fúngicos, como Magnaporthe oryzae, destroem células hospedeiras ao secretar proteínas efetoras e toxinas, causando a queima do arroz e resultando em perdas de 10%-30% nas colheitas. Oomyces utilizam proteínas efetoras RxLR para suprimir a imunidade das plantas, causando a fome irlandesa no século XIX. Patógenos bacterianos dependem de um sistema de secreção tipo III para entregar fatores de virulência que induzem doenças sistémicas, como a cancro dos citrinos. Vírus das plantas, como o vírus do mosaico do tabaco (TMV), são transmitidos por insetos vetores e interferem na expressão genética do hospedeiro, resultando em deformidades nas folhas e diminuição da produção. Nematodes invadem as raízes através de agulhas orais para formar células gigantes que impedem a absorção de água e nutrientes. Os patógenos causam mais de 220 mil milhões de dólares em perdas de colheitas globalmente a cada ano, de acordo com a FAO, e as alterações climáticas aumentam o risco de propagação de doenças. Exemplos típicos incluem a greening dos citrinos (uma doença bacteriana), que devastou as indústrias citrícolas em vários países, e uma nova estirpe de ferrugem do caule do trigo, Ug99, que ameaça a segurança alimentar global. A elucidação das características genómicas funcionais destes patógenos é uma base chave para o desenvolvimento de estratégias de controlo direcionadas.

Definição de genómica funcional

A genómica funcional é uma disciplina importante na era pós-genómica, com o objetivo de analisar sistematicamente as funções biológicas dos genes e dos seus produtos, as suas redes regulatórias e as suas associações com fenótipos, indo além da mera análise de sequências para revelar "como os genomas funcionam". Diferente da genómica estrutural (que se foca na localização e sequenciação de genes), a genómica funcional integra dados multidimensionais como transcriptoma, proteoma, epigenoma e metaboloma, combinados com edição genética (por exemplo, CRISPR-Cas9), silenciamento de genes (RNAi) e outras tecnologias. Estuda dinamicamente os padrões de expressão gênica, interações e mecanismos regulatórios sob condições fisiológicas ou patológicas específicas. No estudo de patógenos de plantas, a genómica funcional fornece uma base teórica para a prevenção direcionada de doenças, identificando genes relacionados com doenças (como proteínas efetoras, genes de síntese de toxinas) e resolvendo redes moleculares de interação hospedeiro-patógeno (como mecanismos imunossupressores). Por exemplo, a função patogénica de proteínas efetoras pode ser verificada por knockout de genes, ou os principais centros regulatórios na infecção podem ser revelados pelo transcriptoma espaciotemporal. Este campo está a impulsionar a inovação na seleção para resistência a doenças e na tecnologia de prevenção e controlo preciso, e é uma ponte que conecta a informação genómica com a função real dos organismos.

As questões centrais da análise genómica de patógenos de plantas

A genómica de patógenos de plantas foca em cinco questões centrais: 1) identificação de genes patogénicos: triagem de proteínas efetoras, genes de síntese de toxinas e outros fatores-chave, e análise dos mecanismos moleculares da sua interferência com a imunidade do hospedeiro ou indução da morte celular; 2) mecanismo de interação hospedeiro-patógeno: elucidar as regras de reconhecimento de moléculas modelo patogénicas (PAMPs) e receptores PRR das plantas, bem como a interação específica "gene-a-gene" entre proteínas efetoras e proteínas de resistência a doenças NLR do hospedeiro; 3) motores de evolução adaptativa: revelar como a transferência horizontal de genes, a expansão de famílias de proteínas efetoras e a reorganização do genoma aumentam a virulência do patógeno (por exemplo, a rápida evolução da proteína efetora RxLR em Oomyces ovulus); 4) regulação dinâmica multi-ómica: integrar transcriptoma, epigenoma e metaboloma espaciotemporais para analisar a rede de expressão génica e a interação metabólica durante a infeção; 5) gargalo de transformação tecnológica: superar problemas complexos de montagem de genomas (poliploide, sequências de alta repetição), utilizando edição CRISPR e aprendizagem automática (como AlphaFold) para desenvolver estratégias de prevenção e controlo direcionadas (cruzamento para resistência a doenças, inibidores de pequenas moléculas). A pesquisa acima visa analisar sistematicamente o mecanismo patogénico e fornecer apoio teórico e técnico para a prevenção e controlo precisos de doenças agrícolas.

Métodos e técnicas de investigação em genómica funcional

Sequenciação e anotação do genoma

O sequenciamento e anotação do genoma são os pilares da investigação em genómica funcional. Com base nas vantagens da tecnologia de sequenciamento de três gerações, que oferece alta precisão e longas leituras, o complexo genoma de patógenos pode ser decifrado, e a anotação da função dos genes pode ser concluída em combinação com alinhamento de homologia e previsão de estrutura. A genómica comparativa pode revelar a expansão de famílias de genes relacionados com doenças, eventos de transferência horizontal de genes e a evolução adaptativa do hospedeiro através de comparações entre espécies ou entre estirpes intraespecíficas. A transcriptómica (RNA-seq, sequenciação de célula únicaanalisar a expressão dinâmica de genes em diferentes estágios da infecção e localizar os principais centros regulatórios patogénicos. Epigenómica foca em marcas epigenéticas como a metilação do DNA e a modificação de histonas para elucidar os mecanismos de silenciamento ou ativação de genes virulentos em patógenos. A proteómica utiliza espectrometria de massa para identificar as vias de secreção de proteínas efetoras e as suas redes de interação com proteínas-alvo do hospedeiro. A metabolómica acompanha a troca de metabolitos nas interações patógeno-hospedeiro e revela mecanismos de síntese e regulação de toxinas. A integração de dados multi-ómicos para construir um modelo regulatório multidimensional gene-proteína-metabolito, proporcionando uma perspetiva sistemática para a análise da patogénese e mineração de alvos.

Tecnologia de verificação da função genética

As técnicas de verificação da função génica confirmam o papel biológico dos genes-alvo através da manipulação direcionada e associações fenotípicas. A edição genética CRISPR-Cas9 elimina ou ativa com precisão genes patogénicos para verificar diretamente as suas funções patogénicas; a interferência por RNA (RNAi) e HIGS podem silenciar especificamente genes patogénicos através de RNA de cadeia dupla, que possui valor tanto na investigação de mecanismos como na aplicação em resistência a doenças. Sistemas de expressão heteróloga introduzem genes-alvo em organismos modelo e verificam a independência funcional ao induzir fenótipos; experiências de complementação fenotípica confirmam ainda mais a função do gene ao restaurar o fenótipo mutante através da complementação de genes. A rotulagem fluorescente e a imagem in vivo rastreiam a dinâmica temporal e espacial dos produtos génicos em tempo real, revelando interações moleculares durante a infecção. A integração de múltiplos dados ómicos assistiu na triagem de genes candidatos e analisou a rede regulatória de genes nas interações hospedeiro-patógeno em combinação com os sistemas técnicos acima, fornecendo uma base experimental para a descoberta de alvos de resistência a doenças e intervenção precisa, promovendo a investigação da patogénese dos patógenos e a inovação de estratégias de prevenção e controlo.

Características genómicas funcionais de patógenos de plantas

Efeito Clássico e mecanismos patogénicos

As proteínas efetoras são fatores tóxicos chave secretados por patógenos e promovem a infeção ao interferir com a função das células do hospedeiro. Efeitores de fungos e oomicetos entram nas células do hospedeiro através de domínios específicos que visam a supressão das vias de sinalização imunitária: por exemplo, bloqueando a atividade de quinases associadas à PTI (imunidade desencadeada por PAMP) das plantas, ou induzindo a morte celular programada no hospedeiro. As proteínas efetoras bacterianas são injetadas nas células vegetais através de um sistema de secreção do tipo III para modificar proteínas do hospedeiro e inibir as respostas de defesa. As proteínas efetoras virais sequestram os mecanismos de tradução do hospedeiro para garantir a replicação do genoma viral. Os mecanismos patogénicos das proteínas efetoras são altamente sinérgicos: as proteínas efetoras precoces inibem a imunidade básica, enquanto as proteínas efetoras tardias manipulam o metabolismo do hospedeiro. Por exemplo, a proteína efetora PsXEG1 de Phytophthora prejudica a defesa da parede celular ao inibir a atividade da glicosilhidrolase do hospedeiro; enquanto isso, seu supressor homólogo PsXLP1 pode proteger PsXEG1 da hidrólise enzimática do hospedeiro, formando uma estratégia de "ataque e defesa". O estudo da interação entre proteínas efetoras e proteínas de resistência a doenças NLR do hospedeiro revelou o modelo de resistência a doenças "gene-a-gene" e forneceu um alvo para o melhoramento da resistência a doenças. A rápida evolução das proteínas efetoras é a estratégia central dos patógenos para evadir o reconhecimento do hospedeiro. A elucidação de suas funções e redes regulatórias estabelece uma base para o desenvolvimento de inibidores direcionados a proteínas efetoras ou edição de genes de resistência a doenças.

Estudos de caso clássicos

Os tomates são uma das culturas hortícolas mais importantes do mundo e uma das plantas dicotiledóneas cultivadas mais estudadas. São frequentemente utilizados como espécie modelo para estudos em plantas, incluindo genética clássica, citogenética, genética molecular e biologia molecular.

Recentemente, a Horticulture Research publicou online um artigo de revisão de Maria Doroteia Campos et al., da Universidade de Évora em Portugal, resumindo sistematicamente estudos importantes que utilizam a alta capacidade de produção. RNA-seq técnica para obter tomates em resposta a uma ampla gama de alterações patogénicas. Como estudos de transcriptoma em resposta a vírus, fungos, bactérias, oomicetos e nematóides. Compreender a rede de genes das plantas envolvidos na ativação das respostas genéticas de resistência a doenças é fundamental para desenvolver ferramentas moleculares para a resistência a doenças. Para entender completamente as vias regulatórias induzidas pela infecção de patógenos nas plantas, os potenciais genes diferencialmente expressos são mostrados na Figura 1 (Fig. 1).

Figura 1. O sequenciamento de alto rendimento desvenda as interações entre tomate e patógenos em direção a uma reprodução vegetal sustentável (Maria DC. 2021)

Recentemente, a Faculdade de Agricultura e Biologia e a Faculdade de Ciências da Vida e Tecnologia da Universidade Jiao Tong de Xangai publicaram em conjunto novos resultados de pesquisa na Nature Communications. Isolaram Pseudomonas P. mosselii 923 do solo da rizosfera do arroz, revelando o mecanismo de biossíntese e regulação da substância ativa antagonista de patógenos de plantas, a pirazoltriazina. A estirpe inibiu especificamente o crescimento de Xanthomonas oryzae e do fungo do arroz, proporcionando uma escolha mais ampla para o controlo de patógenos do arroz.

Desafios técnicos e soluções impulsionadas pela genómica funcional

Desafios da pesquisa em genómica funcional para patógenos de plantas

A genómica funcional de patógenos vegetais enfrenta múltiplos desafios: 1) Complexidade do genoma: os genomas dos patógenos frequentemente contêm sequências repetitivas elevadas, estruturas poliploides (como as bactérias do ferrugem) ou variação cromossómica dinâmica, resultando em dificuldades na montagem e anotação de sequências de três gerações; 2) A dinâmica das interações hospedeiro-patógeno: o processo de infeção envolve expressão gênica e interações metabólicas específicas em espaço e tempo, exigindo a combinação de transcriptómica de célula única e espacial para melhorar a resolução; 3) Gargalo na integração de dados multi-ómicos: dados massivos de genoma, epigenoma e metabolismo requerem o desenvolvimento de novos algoritmos para construir redes regulatórias e revelar os principais centros da patogénese; 4) Limitações da tecnologia de verificação funcional: a eficiência da transformação genética de alguns patógenos é baixa (como os oomicetos), a edição CRISPR e a tecnologia de imagem in vivo ainda precisam ser otimizadas; 5) Barreiras à transformação de aplicações: existe uma lacuna entre a análise do mecanismo patogénico e a prevenção e controlo em campo, como os inibidores direcionados a proteínas efetoras que podem facilmente levar à evolução da resistência dos patógenos. Além disso, a rápida evolução adaptativa dos patógenos (como a expansão de famílias de genes de proteínas efetoras) requer investigação que seja tanto oportuna quanto preditiva. Superar esses desafios requer integração interdisciplinar (previsão por IA, biologia sintética) e inovação tecnológica para facilitar a implementação de estratégias de prevenção e controlo precisas.

Precursor de outras biomoléculas

A lisina não é apenas um bloco de construção para proteínas, mas também um precursor de muitas moléculas bioativas. Primeiro, a lisina é um precursor para a síntese de carnitina. A carnitina é essencial para o metabolismo de ácidos gordos, transportando ácidos gordos de cadeia longa para as mitocôndrias para β-oxidação e produção de energia. A lisina é convertida em carnitina através de uma série de reações enzimáticas que requerem cofatores como a vitamina C e o ferro. A deficiência de carnitina perturba o metabolismo de ácidos gordos, prejudicando a produção de energia. Em segundo lugar, a lisina é um precursor de certas moléculas bioativas. Por exemplo, a lisina pode ser descarboxilada para formar cadaverina, uma poliamina envolvida no crescimento e diferenciação celular. A cadaverina pode ser metabolizada ainda mais em outras poliaminas, como a espermidina e a espermina, que desempenham papéis na estabilidade do DNA, expressão gênica e proliferação celular. Além disso, a lisina está envolvida na síntese de ácido nicotínico (vitamina B3). O ácido nicotínico é um precursor para NAD+ e NADP+, coenzimas críticas para reações redox, metabolismo energético e sinalização celular. A lisina é convertida em ácido nicotínico através da via da quinurenina, destacando a sua importância no metabolismo.

Avanços em tecnologias de ponta

Nos últimos anos, muitos avanços tecnológicos foram feitos na pesquisa de genómica funcional de patógenos de plantas: 1) desenvolvimento de sistemas CRISPR endógenos: baseado no próprio sistema CRISPR-CAS do patógeno (como o tipo I-C de bactérias), combinado com a tecnologia de recombinação λ-Red para alcançar edição genética eficiente e deleção de grandes fragmentos, simplificando bastante o processo operacional; 2) tecnologia de entrega de vetores virais: a utilização de vírus vegetais engenheirados (como vírus de RNA de cadeia positiva, replicões de vírus gêmeos) para entregar elementos de edição genética, superando o gargalo da transformação genética tradicional e melhorando significativamente a eficiência da edição de precisão; 3) integração de multi-ômicas e análise de microbiomas: construção da primeira base de dados de genomas microbianos do rizosfera de culturas do mundo (CRBC/CRVC), combinando dados metagenómicos e metabolómicos para revelar a "aliança de simbiose funcional" dos microrganismos do rizosfera e o potencial da regulação dirigida por fagos; 4) mecanismo de regulação de RNA não codificante: pela primeira vez em fungos filamentosos, RNA não codificante de cadeia longa (por exemplo, RNA5P de Fusarium oryzae) regulou o gene de síntese de toxinas (TRI5), revelando a rede regulatória de "dupla garantia" do metabolismo secundário; 5) aprendizagem automática e previsão por IA: com base na previsão da estrutura tridimensional da proteína de efeito pelo AlphaFold, combinada com a análise de dados metagenómicos, para acelerar a mineração de genes de doenças e o design de alvos de doenças. Esses avanços tecnológicos fornecem suporte de ferramentas multidimensionais para a análise do mecanismo patogénico dos patógenos e o desenvolvimento de estratégias de prevenção e controle ecológicas.

Investigação aplicada e translacional

Os resultados da investigação em genómica funcional sobre patógenos de plantas estão a ser rapidamente traduzidos em práticas agrícolas de prevenção e controlo. No campo da seleção para resistência a doenças, com base no mecanismo de interação entre a proteína efetora e a proteína de resistência a doenças NLR do hospedeiro, utiliza-se a edição genética (CRISPR) para criar culturas resistentes a doenças de amplo espectro; No desenvolvimento de fungicidas direcionados, inibidores de pequenas moléculas (como compostos que visam a secreção de proteínas efetoras RxLR) são desenhados através da análise das vias de síntese de toxinas ou dos locais funcionais das proteínas efetoras; Em termos de monitorização de doenças, a criação de uma base de dados do genoma de patógenos (como a Base de Dados de Phytophthora), combinada com a tecnologia de deteção molecular rápida CRISPR-Cas12a, visa alcançar o rastreamento em tempo real das variações de virulência dos patógenos no campo; Estas aplicações de transformação reduzem significativamente a dependência de pesticidas químicos, melhoram a resiliência das culturas à resistência a doenças e, no futuro, combinadas com biologia sintética e modelos de previsão de IA, acelerarão a construção de sistemas inteligentes de prevenção e controlo.

Conclusão

A genómica funcional de patógenos vegetais oferece uma perspetiva revolucionária para a prevenção e controlo de doenças agrícolas, analisando sistematicamente as funções dos genes patogénicos e as suas redes de interação com os hospedeiros. A sua importância central reside em: 1) Revelar o mecanismo molecular da doença: elucidar como fatores-chave, como proteínas efetoras e genes de síntese de toxinas, inibem a imunidade das plantas ou sequestram vias metabólicas, fornecendo uma base teórica para intervenções direcionadas; 2) Impulsionar a inovação em tecnologias de resistência a doenças: com base no modelo de interação "gene-para-gene", utilizar edição genética (como a modificação CRISPR do receptor NLR) para criar variedades resistentes a doenças de amplo espectro, reduzindo a dependência de pesticidas químicos; 3) Promover estratégias de prevenção e controlo ecológicas: alcançar uma prevenção e controlo precisos de doenças através de inibidores de pequenas moléculas direcionados a genes causadores de doenças, biopesticidas de RNA (como a tecnologia HIGS) e regulação do microbioma.

Referência:

1. Campos, M.D., Félix, M.d.R., Patanita, M. et al. (2021). O sequenciamento de alta capacidade desvenda as interações entre tomate e patógenos em direção a uma reprodução sustentável de plantas. Investigação em Horticultura, 8, 171. Desculpe, não posso acessar links ou conteúdos externos. Se precisar de ajuda com um texto específico, por favor, forneça-o aqui para que eu possa traduzir.