Blueprint de Estudo de Caso: Desenho de um Estudo de Cancro com eccDNA (Cohortes, Controles e Resultados) (RUO)

Introdução

Como transformar o conceito de DNA circular extracromossómico (eccDNA) num plano de projeto prático e auditável que a sua equipa possa executar sob restrições de RUO? Este plano orienta CROs e gestores de projeto através das decisões que mais importam num programa de câncer de eccDNA—desde a definição de coortes e manuseio de amostras até um fluxo de trabalho de enriquecimento centrado na RCA, portões de qualidade, relatórios com evidências classificadas e entregáveis concretos.

Para os leitores que procuram um resumo conciso sobre a biologia e a relevância da pesquisa, consulte a visão geral de fundo no artigo da série. eccDNA no Cancro: Amplificação Genética, Regulação de Oncogenes e Aplicações de Investigação. Aqui, focamo-nos em passar da teoria para um plano que pode ser implementado, com critérios de sucesso claros e resultados que as partes interessadas podem rever e auditar.

O que você levará:

• Um quadro de design de coorte: tumor versus normal emparelhado, e quando adicionar um braço de metástase para comparações em trio.
• Um desenho de estudo prático de sequenciação de eccdna centrado na enriquecimento por RCA, com pontos de pivô para captura híbrida onde faz sentido.
• Um esquema de entregáveis para "eccDNA para amplificação de genes", incluindo visualização estrutural e níveis de evidência.
• Artefatos do projeto que pode usar imediatamente: um cronograma, esquema em trio e layout do painel de relatórios.

Nota de escopo apenas para RUO: Este artigo aborda projetos de pesquisa e não envolve diagnóstico ou tratamento clínico.

Fase 1: Seleção de Coorte e Amostra

A seleção de coorte estabelece as bases para resultados interpretáveis. Em estudos de câncer com eccDNA, amostras tumorais são analisadas para identificar círculos associados a oncogenes e repertórios mais amplos de eccDNA. Normais correspondentes (sangue ou tecido adjacente) atuam como filtros de fundo e ajudam a quantificar sinais específicos do tumor.

• Tumor vs normal emparelhado: Grandes esforços em genómica do câncer mostram que a amplificação de ecDNA/eccDNA é prevalente em vários tipos de tumores e rara em tecidos normais, apoiando o emparelhamento com normais para desvendar círculos específicos do tumor. Para precedentes sobre a amplificação de oncogenes e dinâmicas de heterogeneidade que motivam tais contrastes, veja o trabalho resumido por Weiser et al. na Cancer Discovery de 2025 e por Kim et al. (Nature Genetics, 2020; doi:10.1038/s41588-020-0678-2) sobre a associação de ecDNA com maus resultados.
• Braço de metástase opcional (trio): Um design de tumor–metástase–normal correspondente captura dinâmicas espaciais ou evolutivas da amplificação circular de oncogenes. A amostragem em trio é valiosa quando a questão de pesquisa envolve seleção entre locais ou ao longo do tempo, apoiada pela literatura sobre heterogeneidade de ecDNA (por exemplo, Turner et al., Nature, 2017; doi:10.1038/nature21356). Embora os trios de eccDNA sejam menos padronizados do que os estudos de ecDNA baseados em WGS, a justificativa é forte para estudos de caso focados na progressão.

Números de amostras e equilíbrio: Para análise de descoberta e centrada no local, assegure-se de ter tumores suficientes para observar padrões recorrentes (por exemplo, 20–50 em uma coorte focada) e inclua pelo menos um normal emparelhado por tumor. Se adicionar metástase, o poder para contrastes pode exigir amostras adicionais, dependendo da heterogeneidade e do tecido disponível.

Preservação e manuseamento de amostras

• Tecido rapidamente congelado (preferido para sequenciação): Preserva DNA de maior integridade, suporta deteção robusta de eccDNA e análise estrutural. Registar metadados pré-analíticos (tempo de recolha, isquemia a frio, temperatura de armazenamento, tempos de congelação) para manter a auditabilidade e rastreabilidade.
• Tecido FFPE (embebido em parafina fixada em formalina): Viável para visualização ortogonal (por exemplo, FISH) de focos de amplificação de genes/ecDNA e para material retrospectivo. O DNA FFPE é frequentemente fragmentado e entrelaçado, complicando a RCA. Se o FFPE tiver de ser utilizado, planeie a desparafinação, o tratamento com protease e a cuidadosa desconexão, e considere mudar para captura direcionada para interrogação específica de locus. Métodos práticos de FISH em FFPE são descritos em um protocolo JoVE de 2024 (doi:10.3791/66978).

Metadados pré-analíticos e cadeia de custódia

Capture o seguinte na entrada e mantenha durante o processamento:

• IDs de biobanco/amostras; local de recolha; data e hora.
• Tempo de isquemia fria; condições de armazenamento (temperatura, duração); registos de transporte.
• Massa do tecido; estimativa do conteúdo tumoral, se disponível.
• Plataforma(s) de análise pretendida(s) e método de enriquecimento.

Portas de aceitação antes do enriquecimento:

• A integridade do DNA (DIN ou equivalente) deve ser consistente com as necessidades subsequentes; se o DIN não estiver disponível, utilize distribuições de tamanhos de fragmentos (por exemplo, Bioanalyzer) e quantificação com Qubit.
• Pureza (razões A260/280 e A260/230 dentro de intervalos aceitáveis); ausência de inibidores.
• Limiares mínimos de entrada (definidos por protocolo; o RCA pode acomodar entradas baixas, mas estabelece um limite para a reprodutibilidade).

Fase 2: Fluxo de Trabalho RCA-primeiro para câncer de eccdna

A nossa narrativa principal segue a depleção de DNA linear, seguida pela amplificação em círculo rolante (RCA) baseada em phi29, comumente referida como enriquecimento ao estilo Circle-Seq, porque oferece alta sensibilidade e suporta baixas quantidades de entrada—particularmente útil em amostras tumorais com material limitado.

Enriquecimento RCA: especificidades a nível de protocolo que pode adotar.

Um fluxo de trabalho típico e auditável com parâmetros de exemplo (ajustar conforme o SOP e os fornecedores de reagentes):

1. Extração de DNA de tecido tumoral/normal congelado rapidamente

   • Entrada alvo: 10–200 ng de DNA por reação (RCA é tolerante a baixas entradas; defina o seu limite inferior com base na reprodutibilidade em ensaios piloto).
   • QC: Concentração de qubits; A260/280 ~1,8–2,0; perfil de fragmentos mostrando a maioria >1 kb.

2. Depleção de DNA linear (exonuclease dependente de ATP)

   • Exemplo de reagente: DNase dependente de ATP Plasmid-Safe (PS-DNase).
   • Reacção: 37°C durante 30–60 min por ciclo; adicionar ATP e enzima por um total de 2–3 ciclos.
   • Ensaios de controlo: PCR para um locus linear conhecido (por exemplo, gene doméstico genómico) antes e depois da digestão para confirmar a depleção.

3. Amplificação por Círculo Rolante (phi29)

   • Exemplo de reagente: kit de polimerase phi29 REPLI-g ou equivalente.
   • Reação: 30°C durante 8–16 horas; terminar conforme as instruções do kit.
   • Notas: Evitar vortexing excessivo; manter práticas de sala limpa para reduzir o risco de contaminação.

4. Limpeza e preparação da biblioteca

   • Limpeza: purificação baseada em esferas SPRI; eluir em tampão com baixo teor de EDTA.
   • Preparação da biblioteca: compatível com Illumina; tamanhos de inserção alvo de 300–500 bp; ciclos de PCR ≤8 sempre que possível; considere UMIs se antecipar duplicação.

5. Sequenciamento

   • Leitura curta: 2×150 pb em pares; 10–30 milhões de pares de leituras por amostra para Circle-Seq enriquecido; aumentar a escala para tumores complexos.
   • Leitura longa (nível opcional): leituras que abrangem junções ONT/PacBio; cobertura de leitura longa de ≥10×–20× para chamadas estruturais de alta confiança ao focar em grandes círculos.

6. Controlo e normas

   • Controles negativos: Controle sem template; normal correspondente por tumor.
   • Spike-ins: Controlo de ADN circular sintético em tamanhos/concentrações conhecidos para avaliar a recuperação e o viés.
   • Replicados em lote: Inclua pelo menos um replicado técnico por lote para avaliação da reprodutibilidade.

Considerações conhecidas e mitigação

• Viés da RCA em relação a círculos pequenos/ricos em repetições: Distribuições de tamanhos de documentos; aplicar filtros conscientes de repetições; priorizar a validação de leituras longas para círculos de oncogenes chave.
• Quimeras devido à troca de molde: Utilize passos de bioinformática que identifiquem leituras quiméricas; corrobore as junções entre réplicas.
• Manuseio de mtDNA: Relate os elementos circulares mitocondriais separadamente ou filtre dependendo da intenção do estudo; defina isto na seção de Métodos.

Manual de resolução de problemas

• Carregamento de DNA linear: Aumentar ciclos de PS-DNase; verificar níveis de ATP; prolongar o tempo de digestão; repetir verificação de depleção de PCR.
• Baixo rendimento de amplificação: Confirmar a pureza do ADN; prolongar a incubação da RCA; verificar o lote da enzima; aumentar a quantidade de entrada dentro dos limites do SOP.
• Alta duplicação ou viés: Reduzir ciclos de PCR; otimizar a limpeza com esferas; considerar UMIs ou ajustar a distribuição do tamanho do inserto.
• Dificuldades do FFPE: Se as amostras estiverem fragmentadas, considere a captura híbrida direcionada a oncogenes em vez de RCA; inclua etapas de descrossligação (digestão com proteinase K, desnaturação cuidadosa por calor) e aceite uma carga de validação mais elevada.

Divulgação: CD Genomics Serviços de Sequenciação de eccDNA & Análise Bioinformática suporta o enriquecimento baseado em RCA e a análise subsequente para projetos RUO. Esta menção é informativa; a seleção de parceiros deve seguir a avaliação de fornecedores e os sistemas de qualidade da sua organização.

Quando mudar para captura híbrida

A captura híbrida (por exemplo, painéis personalizados direcionados a loci de oncogenes como MYC, EGFR, MYCN) pode melhorar a uniformidade a nível de locus e a resolução estrutural quando:

• O projeto é orientado por hipóteses e focado em círculos específicos de oncogenes.
• As amostras estão fragmentadas (FFPE), tornando o desempenho da RCA menos previsível.
• A certeza estrutural em locais definidos é o objetivo principal.

Métodos direcionados como o CRISPR-CATCH (Nature Genetics, 2022; doi:10.1038/s41588-022-01190-0; veja a página da revista: Perfilagem direcionada de ecDNA humano com CRISPR-CATCH) demonstrar como o isolamento específico de locus e o sequenciamento de alta resolução podem resolver estruturas de ecDNA em câncer humano—útil para projetos que enfatizam a topologia detalhada e pontos de quebra.

Modalidades de sequenciamento e profundidade

• Leitura curta (Illumina): Padrão para saídas do Circle-Seq e deteção de junções com ferramentas como Circle-Map. Defina alvos de profundidade de leitura com base no tamanho da coorte e na complexidade esperada; conjuntos de dados enriquecidos típicos utilizam dezenas de milhões de leituras pareadas por amostra.
• Leitura longa (ONT/PacBio): Adicione quando a confirmação estrutural for crítica ou quando se espera que os círculos sejam grandes (>10 kb). Leituras longas abrangem junções e suportam montagens para confirmação de topologia.

Métricas de qualidade e critérios de sucesso

Defina e monitore portões em cada etapa. Exemplos que pode adaptar:

• Qualidade de biblioteca/dados: Q30 ≥ 80%; taxa de mapeamento ≥ 85–90%; duplicação dentro da faixa aceitável para a sua estratégia de biblioteca; parâmetros de aparagem de adaptadores/qualidade documentados (por exemplo, phred ≥30).
• Eficiência de enriquecimento: Aumento demonstrável na deteção de eccDNA por Gb em comparação com entradas não enriquecidas; recuperação de spike-in dentro de ±20% do esperado; distribuição do tamanho dos círculos reportada.
• Fundo/contaminação: Controles negativos com chamadas circulares quase zero; proporções de leituras quiméricas abaixo do limite definido; PCR de locus linear negativo após digestão.
• Reproduzibilidade: Recorrência de círculos-chave em replicados técnicos; concordância entre lotes para spike-ins; variância explicada documentada.

Para uma discussão detalhada dos critérios de sucesso em projetos de eccDNA, consulte o nosso artigo em série. Métricas de Qualidade para Sequenciação de eccDNA: Eficiência de Enriquecimento, Fundo e Reprodutibilidade.

Alinhar o fluxo de trabalho com relatórios e análise

À medida que finaliza o fluxo de trabalho, assegure-se de que o plano de análise subsequente esteja claro e versionado. Para escolhas experimentais passo a passo e variantes de preparação de bibliotecas, o guia da série Fluxo de Trabalho Experimental para Sequenciação de eccDNA: Enriquecimento, Preparação de Biblioteca e Armadilhas Comuns fornece detalhes complementares a este plano.

Fase 3: Entregáveis de Dados (Avançado)

Os interessados esperam um conjunto de entregáveis que seja tanto abrangente quanto auditável. Aqui está um esquema prático para os outputs e visualizações associadas ao "eccdna para amplificação de genes".

Lista de candidatos para eccDNA associado a oncogenes

Forneça uma tabela (normalmente entregue como CSV/TSV mais um relatório legível por humanos) com as seguintes colunas:

• ID do Candidato.
• Símbolo(s) de gene transportado(s) no círculo.
• coordenadas hg38 para junção(ões) e extensão circular; comprimento (pb).
• Suporte de junção: contagens de leituras divididas e contagens de leituras discordantes.
• Número de cópias estimado ou razão de cobertura (contextualizado com WGS de tumor ou profundidade).
• Nível de evidência (1–3) indicando certeza estrutural (definido abaixo).
• Estado de validação (PCR/Sanger, FISH, suporte de leitura longa).
• Anotações (conteúdo repetido, elementos de realce, contexto de via).
• Presença da amostra: tumor, normal correspondente, metástase; contagens por amostra onde informativas.
• Ficheiros ligados: BED/BEDPE, fatias BAM, FASTA para círculos montados.
• Bandeiras de QC (região rica em repetições, viés de intervalo de tamanho de RCA, potenciais assinaturas quiméricas).

Linha de exemplo (ilustrativa, não dados reais):

• Candidato: CIRC-0001; Gene: MYC; Intervalo: chr8:127,735,000–127,745,000; Leituras de junção: dividido 42, discordante 18; Estimativa de cópias: alta; Nível de evidência: 2; Validação: PCR/Sanger positivo para fora; Ficheiros: circ0001.bedpe, circ0001.bam.slice; Sinais de QC: região densa em repetições.

Visualização estrutural de círculos de oncogenes

Visualize círculos candidatos a transportar oncogenes (por exemplo, MYC, EGFR, MYCN) com:

• Diagramas de junção mostrando pontos de interrupção e posições de genes.
• Gráficos de cobertura indicando o contexto de amplificação.
• Alinhamentos de leituras longas que abrangem junções sempre que disponível.
• Sobreposições de mapeamento óptico opcionais para estruturas complexas.

Esquema de classificação de evidências

Utilize uma abordagem de hierarquização de evidências para transmitir confiança e orientar os acompanhamentos:

• Nível 1: Leituras de longa extensão que abrangem junções e/ou montagem que confirma a topologia circular; suporte de mapeamento óptico opcional; validação ortogonal positiva.
• Nível 2: Evidência de junção de leitura curta mais confirmação por PCR/Sanger para fora da junção; modelo estrutural plausível; suporte parcial de leitura longa.
• Nível 3: Chamadas de leitura curta computacional sem validação ortogonal; sinalizadas para acompanhamento ou sequenciação direcionada de leitura longa.

Conteúdos do pacote de relatórios e versionamento

Cada relatório deve incluir:

• Métodos e parâmetros: versões das ferramentas (por exemplo, Circle-Map vX.Y, eccDNA-pipe vZ), definições de alinhamento, limiares de filtragem, definições de níveis de evidência.
• Resumo de QC: eficiência de enriquecimento, taxa de mapeamento, níveis de duplicação, recuperação de spike-in, estado do controlo negativo.
• Tabelas de dados: lista de candidatos, presença/ausência por amostra, resultados de validação.
• Visualizações: diagramas de estrutura, perfis de cobertura, instantâneas de evidência de leitura longa.
• Ficheiros entregues: fatias BAM, BED/BEDPE, montagens FASTA (quando disponíveis), relatório em PDF.
• Apêndice de auditoria: registo da cadeia de custódia, referências de SOP, desvios e ações corretivas.

Para algoritmos de bioinformática, estratégias de filtragem e padrões de reporte, consulte Bioinformática para eccDNA: Algoritmos de Detecção, Filtragem de Artefatos e Normas de Reporte.

Ativos Visuais

Abaixo estão três artefatos de projeto que você pode reutilizar ou adaptar. Eles foram concebidos para apoiar o planeamento, a comunicação e o alinhamento das partes interessadas.

Figura 1 — Cronograma do projeto para um estudo de câncer com eccDNA RUO, mostrando as fases principais (coleta de amostras → depleção de DNA linear + enriquecimento RCA → preparação da biblioteca → sequenciação → bioinformática → validação → relatório) com portões de QC e pontos de decisão para resolução de problemas e validação ortogonal.

Figura 2— Trio tumor-metástase-normal para identificar eccDNA específico do tumor

Figura 3—Painel do relatório final mostrando os principais hits de oncogenes eccDNA, níveis de confiança e métricas de QC chave.

Dicas Práticas e Controlo de Riscos

• Mantenha a sua cadeia de custódia clara e auditável. Utilize tubos com código de barras, transferências rastreadas e etapas de armazenamento registadas.
• Defina previamente os critérios de falha e aceitação. Se os controlos negativos apresentarem chamadas circulares não triviais, pause e resolva problemas na digestão por exonuclease.
• Planeie validações ortogonais cedo. Para candidatos de Nível 1, aloque tempo para sequenciação de leitura longa; para Nível 2, agende PCR/Sanger externo.
• Considere estudos de perturbação para o stress de replicação (por exemplo, hidroxiureia) apenas quando questões mecanicistas impulsionarem o design; assegure que os controlos e os metadados de exposição sejam rigorosos. Para considerações de design de estudo relacionadas com o stress de replicação, consulte o artigo da série. Estresse de Replicação e eccDNA: Hidroxiureia, Efeitos do Ciclo Celular e Considerações sobre o Design do Estudo.
• Envolva a bioinformática desde cedo para definir níveis de evidência e regras de filtragem antes da chegada dos dados. Isto evita a adaptação de limiares a posteriori.
• Documente as desvios e ações corretivas imediatamente; adicione-os ao apêndice da auditoria no relatório final.

Conclusão e Próximos Passos (RUO)

Projetar um estudo de cancro com eccdna que resista a escrutínio significa tomar um punhado de decisões cruciais desde o início—composição da coorte, preservação de amostras, estratégia de enriquecimento, modalidades de sequenciação e plano de validação—e documentar os critérios de qualidade em cada etapa. Uma narrativa centrada na RCA é frequentemente o caminho mais eficiente para a descoberta e amostras de baixo input, com captura híbrida como uma opção direcionada quando a certeza estrutural a nível de locus é primordial ou quando predominam materiais FFPE.

Alinhar as partes interessadas sobre os entregáveis antes do envio da primeira amostra: o esquema da lista de candidatos para "eccdna para amplificação de genes", definições de níveis de evidência, expectativas de visualização e limiares de controlo de qualidade. Construir o plano do projeto em torno da linha do tempo de Gantt e do esquema tríplice, e publicar o layout do painel de controlo simulado para que todos saibam como será o "sucesso".

Se a sua organização colabora com fornecedores externos para etapas específicas—enriquecimento, sequenciação de long-read ou validação ortogonal—assegure-se de que os SOPs dos fornecedores e os relatórios de QC se integrem de forma adequada com o seu registo de auditoria e requisitos de RUO.

Autor

Yang H. — Cientista Sénior, CD Genomics; Universidade da Florida.

Yang é um investigador em genómica com mais de 10 anos de experiência em investigação em genética, biologia molecular e celular, fluxos de trabalho de sequenciação e análise bioinformática. Habilidoso tanto em técnicas de laboratório como na interpretação de dados, Yang apoia o design de estudos RUO e projetos baseados em NGS.

Referências:

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