Sequenciação Profunda

O que é Sequenciação Profunda?

A sequenciação profunda implica a análise meticulosa de regiões genómicas através de sequenciação repetida, muitas vezes abrangendo centenas ou até milhares de iterações. Esta tecnologia de ponta sequenciação de próxima geração A abordagem de sequenciação de nova geração (NGS) capacita os investigadores a descobrir tipos de clones, células ou entidades microbianas extremamente raras, mesmo quando representam apenas 1% da amostra original.

Empregando tanto leituras curtas como longas, sequenciação profunda permite a deteção de populações celulares elusivas cruciais na investigação do cancro e microbiana, entre outros campos. A sua utilidade estende-se à discriminação de variações minuciosas dentro dos tumores, uma tarefa complicada pela ocorrência comum de contaminação de células normais em amostras de cancro e pela presença de diversos subclones de células cancerígenas dentro do próprio tumor.

O que é a profundidade de sequenciação?

Após o advento de sequenciação profunda Após a PCR e o sequenciamento de primeira geração, os testes genéticos passaram para uma fase marcada pela adoção generalizada do NGS. Dentro deste panorama, a profundidade de sequenciamento emerge como uma métrica fundamental, significando a especificidade e sensibilidade do sequenciamento profundo. Mas o que é precisamente a profundidade de sequenciamento? Em termos profissionais, a profundidade de sequenciamento denota a razão entre o total de bases (bp) que cobrem a região-alvo e o tamanho do genoma-alvo. Simplificando, representa a frequência com que as bases do gene-alvo são interpretadas de forma iterativa. Analogamente, a interpretação iterativa das bases durante o sequenciamento profundo pode ser comparada ao aprimoramento de uma tarefa repetitiva, onde o aumento da repetição está correlacionado com uma maior habilidade. Consequentemente, uma profundidade de sequenciamento inadequada compromete significativamente a precisão.

O que é a cobertura de sequenciamento?

A cobertura de sequenciamento, por outro lado, descreve a proporção de bases sequenciadas em relação ao tamanho total do genoma. Os protocolos padrão de sequenciamento de genoma normalmente recomendam uma profundidade média de cobertura de 30×. Esta recomendação decorre da observação de que, a esta profundidade, a proporção de cobertura >4× ultrapassa 99,21%, indicativa de que se está a aproximar da saturação. Além disso, neste ponto, o número de heterozigotos polimorfismos de nucleotídeo único Os SNPs tendem a estabilizar. A pesquisa indica que sequenciar a uma profundidade média de 15× atinge a saturação com SNPs puros, enquanto uma cobertura de 30× é suficiente para SNPs heterozigóticos.

A profundidade de sequenciamento mais elevada é sempre preferível?

Em sequenciação profunda de alto rendimentoA profundidade de sequenciamento impacta diretamente a precisão de cada base. Ao analisar um espécime homogéneo onde cada base existe apenas numa forma, uma profundidade de sequenciamento excessivamente alta pode não ser essencial para resultados ótimos. Por outro lado, em espécimes heterogéneos, manter a mesma profundidade de sequenciamento pode resultar em comprimentos de leitura do genoma mais curtos que cobrem as células mais raras.

Considerando o impacto da profundidade de sequenciação na precisão dos testes genéticos, pode-se argumentar a favor de um requisito de maior profundidade de sequenciação. Analogamente, podemos traçar paralelos com as nossas vidas diárias: assim como o tamanho do nosso espaço de vida afeta o nosso nível de conforto, o custo também é uma consideração crucial. Portanto, esforçamo-nos por um equilíbrio ótimo dentro do nosso orçamento. Da mesma forma, dentro de um certo intervalo, o aumento da profundidade de sequenciação melhora a precisão do ensaio. No entanto, a elevação indefinida da profundidade de sequenciação leva a retornos decrescentes: enquanto os custos disparam, as melhorias na precisão tornam-se marginais.

Como Determinar a Profundidade de Sequenciação

A escolha da profundidade de sequenciamento apropriada depende de vários fatores. Na investigação do câncer, por exemplo, a profundidade de sequenciamento necessária aumenta para tumores com baixa pureza, alta policlonalidade e aplicações que exigem uma sensibilidade elevada, como a identificação de clones de baixa frequência. Normalmente, as profundidades de sequenciamento na pesquisa do câncer variam de 80x a vários milhares de vezes. Assim, do ponto de vista da relação custo-eficácia, o teste genético rotineiro para orientação de terapias direcionadas aos pacientes prioriza uma profundidade ótima em vez de uma profundidade máxima, reservando profundidades de sequenciamento muito altas para cenários específicos.

Para testes de NGS de amostras de tecido tumoral, a profundidade de sequenciação efetiva deve exceder 500x, enquanto para espécimes de DNA livre de plasma, deve ultrapassar 1000x.

A profundidade de sequenciamento e a cobertura determinam em parte o nível de confiança associado às variantes identificadas em posições de base específicas. Uma maior profundidade e cobertura implicam mais leituras a cobrir cada base, aumentando assim a confiança nas chamadas de base.

As profundidades recomendadas variam com base no método de sequenciação:

• Sequenciação do genoma completo (WGS): Tipicamente 30× a 50×, dependendo da aplicação e do modelo estatístico.
• Sequenciação do exoma completoA profundidade sugerida é de cerca de 100×.
• Sequenciação de RNAA deteção de genes expressos raros requer uma cobertura e profundidade superiores.
• ChIP-SeqA profundidade aconselhada é de cerca de 100×.

Tecnologia de Sequenciamento Profundo para Oncologia

Especimens tumorais em investigação oncológica apresentam uma paisagem complexa, frequentemente composta por uma mistura de células normais juntamente com múltiplos subclones de células tumorais. Abordar esta complexidade requer uma compreensão subtil da profundidade de sequenciação e do seu papel fundamental em melhorar a precisão e a sensibilidade dos ensaios.

Considerações para Aprofundamento de Sequenciamento Aumentado:

• Pureza do Tumor: A presença de células normais dentro de espécimes tumorais representa um desafio para a deteção precisa de mutações. Tumores com 50% de células normais necessitam de um aumento na profundidade de sequenciação para alcançar o mesmo nível de confiança que amostras isentas de tecido normal.
• Heterogeneidade Tumoral: A policlonalidade é uma característica distintiva de tumores avançados, sublinhando a necessidade de sequenciação mais aprofundada para capturar a diversidade dos tipos de clones presentes. A profundidade da sequenciação deve alinhar-se com a complexidade da arquitetura clonal do tumor para garantir uma deteção abrangente de variantes.
• Sensibilidade Necessária: Revelar clones raros, particularmente aqueles que constituem apenas 1% do tumor original, é fundamental para compreender os mecanismos de resistência a medicamentos e a progressão da doença. Alcançar este nível de sensibilidade exige profundidades de sequenciação significativamente mais profundas do que os padrões convencionais, frequentemente ultrapassando 100x de cobertura.

Ao abordar meticulosamente esses fatores, tecnologia de sequenciação profunda eleva a sensibilidade e precisão dos ensaios oncológicos, capacitando os investigadores a obter informações inestimáveis sobre a biologia tumoral e os mecanismos de resistência terapêutica.

Dados de sequenciação ultra-profunda de um estudo de proficiência em biópsia líquida demonstrando validade analítica. (Gong et al., 2022)

Tecnologia de Sequenciamento Profundo em Virologia

• Vírus da Influenza

Para investigar patógenos potenciais e as suas interações em pacientes afetados por vírus da gripe A, Kuroda M et al. realizaram uma análise abrangente. Eles extrairam RNA total dos pulmões de pacientes que sucumbiram a pneumonia viral causada pelo H1N1, sintetizaram cDNA e realizaram sequenciação de novoO estudo revelou que mais de 98% das sequências pertenciam ao genoma humano, enquanto as sequências do vírus H1N1 e de bactérias constituíam 0,850% e 0,005%, respetivamente.

Além disso, o estudo revelou dois fenómenos de quasi-espécies de aminoácidos em locais específicos dos antígenos hemaglutinina do vírus H1N1, Sa e Ca, corroborados por PCR quantitativa por fluorescência. Adicionalmente, a identificação de um agente de deteção bacteriana sem precedentes e uma infeção bacteriana histologicamente não observada sublinhou a importância das descobertas.

Estas descobertas lançam luz sobre infeções bacterianas anteriormente não reconhecidas, sugerindo uma contribuição mais ampla de potenciais patógenos, incluindo Streptococcus pneumoniae, à morbilidade e mortalidade exacerbadas associadas às infeções virais pelo vírus da gripe A. Consequentemente, a adoção generalizada do sequenciamento profundo como uma ferramenta de deteção de patógenos rápida e rentável surgiu.

• Aplicação na Detecção de Vírus Desconhecidos

O rotavírus é uma das principais causas de gastroenterite aguda em bebés em todo o mundo, sendo a vacinação uma medida preventiva fundamental. O controlo de qualidade das vacinas requer a deteção de fatores exógenos, indicadores cruciais da segurança da vacina. Em 2010, tecnologia de sequenciação profunda facilitou a deteção do circovírus suíno.

Esta deteção marcou um evento significativo na regulamentação da segurança das vacinas, semelhante ao incidente de intussusceção, sublinhando o papel indispensável do sequenciamento profundo na proteção da saúde pública.

• Aplicação em Vírus de Plantas

a sequenciação de próxima geração (NGS) como uma ferramenta poderosa na identificação de patógenos desconhecidos em várias espécies de plantas. Por exemplo, Li et al. utilizaram NGS para analisar pequenos RNAs de amostras de tomate que apresentavam sintomas diversos. Ao enriquecer e montar pequenos RNAs interferentes derivados de vírus (vsiRNAs), identificaram uma sequência completa do genoma do viroide do tubérculo em espiral da batata (PSTVd) e confirmaram a presença de duas estirpes do vírus do mosaico do pepino (PepMV) nas amostras dos Estados Unidos. Além disso, novas estirpes de PepMV foram descobertas em amostras mexicanas, destacando a utilidade de sequenciação profunda na descoberta de novos vírus e estirpes de plantas.

Referência:

1. Gong, B., Deveson, I.W., Mercer, T. et al.Dados de sequenciação ultra-profunda de um estudo de proficiência em biópsia líquida demonstrando validade analítica. Dados Científicos nove, 170 (2022).