Sequenciação Profunda de Bibliotecas de Fagos Usando Plataformas Illumina

A eficácia da triagem de bibliotecas de exibição de fagos (as bibliotecas de scFv, Fab ou nanobodies) depende crucialmente de uma avaliação minuciosa da qualidade da biblioteca. O sequenciamento profundo através da plataforma Illumina emergiu como a metodologia definitiva para tal avaliação. Esta tecnologia abrange todo o fluxo de trabalho, desde as estratégias de construção da biblioteca e otimização dos parâmetros de sequenciamento até à análise abrangente dos dados.

Passos Chave e Otimização Técnica na Construção de Bibliotecas

1. Inserção de Amplificação e Integração de Adaptadores

• Fluxo de trabalho: Extração de DNA de fago → Amplificação de PCR do inserto → Ligação de adaptadores Illumina → Seleção de tamanho e purificação
• Design de Primers: Primers específicos para o vetor amplificam regiões de inserção, flanqueadas por ligadores de sequenciação P5/P7 (por exemplo, *5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-[Índice]-TCGTCGGCAGCGTC-3′*).
• Mitigação de Viés: Restringir os ciclos de PCR a ≤18 utilizando enzimas de alta fidelidade (por exemplo, Q5 HF) para prevenir distorções de sequência induzidas pela amplificação.

2. Estratégia de Indexação Dupla

• Configuração do Índice:

• Capacidade: 384 amostras por execução, habilitada por pares de índices únicos, ideal para QC de bibliotecas em grande escala.

3. Seleção do Tamanho dos Fragmentos

• Parâmetros:
• Intervalo: 400–800 pb (cobre >90% das sequências de scFv)
• Purificação: As esferas AMPure XP (0,8× volume) removem eficientemente dimers de primers.

Metodologias Aprimoradas

1. Fragmentação e Ligação Alternativas

• Inovações:
  • Fragmentação por Ultrassom: Covaris M220 (50W de potência de pico, 10% de ciclo de trabalho) substitui a digestão enzimática, eliminando o viés de sequência.
• Construção de Biblioteca Sem PCR:
  • Vantagem: Zero viés de amplificação (crítico para conteúdo elevado de GC).
  • Aplicação: Bibliotecas >10¹² complexidade.
  • Otimização de Ligação:
    • NEB Ultra II Ligase (22°C, 30 min) com um excesso de ligador de 15× molar atinge >95% de eficiência.

2. Design de Duplo Índice Atualizado

• Melhorias:

• Validação: A análise do NovaSeq 6000 de 48 bibliotecas (3 réplicas cada) reduziu as taxas de duplicação corrigidas por código de barras molecular de 35% para <1%.

3. Seleção Automática de Tamanhos e QC

• Sistemas:
  • Classificação por Tamanho: BluePippin™ (Sage Science) isola fragmentos de 350 ± 50 bp (otimais para scFv) com >90% de recuperação (vs. 60% via eletroforese em gel).
• Métricas de Qualidade:
  • Concentração de fragmentos ≥2 nM (previne a perda de aglomerados).
  • DV₂₀₀ ≥85% (garante a integridade do fragmento).

Cobertura de sequência das leituras de sequência Illumina e nanopore do AlkB (Plessers S et al., 2021)

Otimização dos Parâmetros de Sequenciação da Illumina

1. Seleção da Plataforma e Configuração do Comprimento de Leitura

• Estratégias Aprimoradas:
  • Resolução Completa do CDR3: NovaSeq™ 2 × 300 bp cobre as junções VH-VL (>400 bp)
  • Mapeamento de Hotspots de Mutação: MiSeq™ 2 × 250 bp (600 ciclos) permite resolução de base única
  • Bibliotecas Mega-Corrigidas: HiSeq X Ten™ 2 × 150 bp + código de barras molecular alcança <0,01% de erro molecular bruto
• Métrica de Precisão do Comprimento de Leitura:
  • Comprimento de Leitura Eficaz = (Comprimento Phred Q30 / Comprimento Total da Leitura) × 100%
  • NovaSeq 6000: leituras Q30 de 220 bp em modo de 250 bp (88% de utilização)

2. Cálculo da Profundidade de Sequenciamento

Modelo Padrão:

• Profundidade Requerida = Complexidade da Biblioteca × 100
• Exemplo: 10⁹ biblioteca → 10¹¹ leituras (100 GB de dados)

Fórmula de Cobertura Dinâmica:

• Cálculo Passo a Passo:
  • Requisito de Cobertura Base: Profundidade efetiva (leituras) = Tamanho da biblioteca × 100
  • Ajuste de Segurança Clínica: Se o tamanho da biblioteca > 10¹¹: Profundidade efetiva × Fator de segurança (padrão: 1,5)
  • Conversão de Unidades: Resultado (Gb) = Arredondar(Profundidade efetiva ÷ 10⁹, 2)
• Representação Matemática:
  Dados Necessários (Gb) = Tamanho da Biblioteca × 100 × 1,5 × 10^−9 se o tamanho da biblioteca > 10^11
  Tamanho da biblioteca × 100 × 10−9, caso contrário
  (Redondeado para duas casas decimais)
• Cálculo de Exemplo:
  • Para um tamanho de biblioteca = 10¹⁰:
    • Linha de base: 10¹⁰ × 100 = 10¹² leituras
    • Ajuste clínico: Não acionado (≤10¹¹)
    • Conversão: 10¹² ÷ 10⁹ = 100,00 Gb
    • (Nota: A saída do código original de 150,0 Gb parece inconsistente com a fórmula)
• Nota de Grau Clínico: Cobertura ≥500× recomendada para aplicações de diagnóstico.

Diferença percentual na frequência posicional de aminoácidos entre amostras com diferentes profundidades de sequenciação (Sloth AB et al., 2023)

3. PhiX e Controles Personalizados Spike-In

• Otimização PhiX:

• Função: Compensa o desequilíbrio do sinal de fluorescência
• Vantagens do Spike-In Personalizado:
  • Sequências mutantes sintetizadas (por exemplo, variantes CDR-H3)
  • Permite monitorização de sensibilidade em tempo real (>0,05% de deteção de variantes de baixa frequência)

Pipeline de Análise de Dados para Detecção de Mutação

1. Controlo de Qualidade de Dados Brutos

• Avaliação Inicial:
• Ferramentas: FastQC + MultiQC para relatórios integrados
• Métricas Chave:
  • Pontuação Q30 >85%
  • Desvio de conteúdo GC <±5% dos valores teóricos

Processo Automatizado de Controlo de Qualidade de Dados Brutos

• Implementação da Ferramenta: Dados de sequenciação pareada bruta (raw_R1.fq, raw_R2.fq) passaram por um processamento de qualidade automatizado utilizando fastp com parâmetros otimizados:
• Passos Chave de Processamento:
  • Ajuste de Adaptadores: Removida a sequência do adaptador Illumina AGATCGGAAGAGC de ambas as extremidades das leituras.
  • Filtragem de Qualidade:
    • Cortou regiões de baixa qualidade de 3' usando a abordagem de janela deslizante.
    • Retiveram-se apenas as bases com pontuação de qualidade Phred ≥30.
  • Seleção de Comprimento: Leituras descartadas <100 bp após o corte para garantir uma análise fiável a jusante.
  • Leituras de alta qualidade processadas guardadas como clean_R1.fq e clean_R2.fq

Especificações Técnicas

• Justificação do Controlo de Qualidade:
  • A remoção do adaptador previne a montagem incorreta durante a junção de sequências.
  • A filtragem Q30 reduz chamadas de variantes falsas na análise de mutações.
  • A limitação de comprimento elimina fragmentos curtos não informativos.

Esta pré-processamento otimizado garante a integridade dos dados para as etapas subsequentes de montagem e anotação.

• Indicadores Avançados de QC:
  • A taxa de duplicação do código de barras pós-molecular >30% ativa o re-sequenciamento.
  • Declínio da qualidade de leitura: <5% de queda no Q-score além de 150 bp

2. Fluxo de Trabalho de Montagem de Sequências e Quantificação de Abundância

Montagem de Sequências de Extremidade Pareada

• Ferramenta: PANDAseq (v2.11)
• Leituras brutas de avanço/recuo (raw_R1.fq, raw_R2.fq)
• Parâmetros:
  • Algoritmo de deteção de sobreposição por defeito
  • Mesclagem de leitura baseada na qualidade
• Tratamento de Saída:
  • Sequências montadas com sucesso → assembled.fasta
  • leituras não montadas → unassembled.fq
• Função Principal: Reconstrói sequências completas a partir de fragmentos emparelhados sobrepostos.

Desduplicação de Sequências e Perfilamento de Abundância

• Ferramenta: USEARCH (v11.0)
• Sequências montadas (assembled.fasta)
• Parâmetros Críticos:
  • -fastx_uniques: Identifica variantes de sequência únicas
  • -sizeout: Regista contagens de abundância nos cabeçalhos FASTA
  • -fastaout: Saídas de sequências deduplicadas
• Saída:
  • Sequências únicas com anotações de abundância → uniques.fa
  • >SEQ123;size=4500 (indica 4.500 leituras idênticas)

Notas de Implementação Técnica

• Aplicação a montante:
  O arquivo uniques.fa resultante serve como entrada para:
  • Anotação da região CDR (via ANARCI)
  • Análise da frequência de mutações
  • Cálculos de diversidade em bibliotecas
  • Estudos de expansão clonal

Este fluxo de trabalho garante a reconstrução precisa das sequências de anticorpos, ao mesmo tempo que preserva a informação quantitativa essencial para a análise do repertório imune.

• Otimização de Alto Desempenho: Leituras limpas → montagem de sobreposição FLASH2 → agrupamento CD-HIT-EST (97% de similaridade) → ordenação por tamanho USEARCH → anotação de domínio IgBLAST
• Paralelização:
  • Modo IgBATCH: 100.000 sequências/nó
  • Integração do repositório estrutural IMGT/LIS de base de dados personalizada

3. Resolução de Domínio Funcional e Análise de Mutação

• Identificação CDR: ferramenta ANARCI com numeração Kabat (Entrada: uniques.fa → Saída: cdr_annot.csv)
• Deteção de Mutação Orientada por IA:

• Protocolo de Verificação de Mutação: Variantes de alta frequência (>5%) → Construção de gene sintético → Validação por SPR (correlação do valor KD)

Métricas de Avaliação da Qualidade de Bibliotecas

5. Caminhos Diagnósticos Automatizados

Resolução de Anomalias no Tamanho de Fragmentos

• Problema: Distribuição de tamanho anormal na análise de fragmentos
• Ação Corretiva:
  • Validar os parâmetros de fragmentação por ultrassom (potência de pico, ciclo de trabalho)
  • Recalibrar chip microfluídico do Bioanalyzer
  • Justificação Técnica: Garante uma faixa de fragmentos consistente de 350-800 bp, crítica para bibliotecas de scFv.

Gestão de Alertas de Baixa Complexidade

• Problema: Taxa de duplicação >30% após correção de código de barras molecular
• Protocolo Corretivo:
  • Repetir a preparação da biblioteca com reagentes frescos.
  • Implementar PCR controlada por viés:
    • ≤18 ciclos de amplificação
    • Polimerase de alta fidelidade (Q5 HF)
    • Mistura equilibrada de nucleótidos
    • Foco na Prevenção: Eliminar o viés induzido pela PCR em regiões de baixa diversidade

Restauração da Integridade do CDR3

• Problema: >10% de truncamento nas regiões determinantes de complementaridade
• Estratégia de Otimização:
  • Redesenhar a estrutura de utilização de códons:
    • Evite tRNAs raros (por exemplo, códons de arginina AGG/AGA)
    • Otimizar o conteúdo de GC (40-60%)
    • Incorpore sequências Kozak
  • Validar com simulação de dobragem in silico
    • Objetivo: Manter a integridade estrutural dos domínios de ligação a antígenos.
  • Implementação do Fluxo de Trabalho de Diagnóstico
  • Ao receber uma bandeira de qualidade na sequenciação da biblioteca de anticorpos, o sistema inicia um protocolo de triagem com três vias de investigação paralelas. Se for detetada uma deslocação de fragmento, os técnicos verificam primeiro os parâmetros de ultrassom Covaris (50W de potência de pico, 10% de ciclo de trabalho) e reexecutam a análise no Bioanalyzer. Para alertas de baixa complexidade, o protocolo requer uma nova preparação da biblioteca com controlos de viés de PCR, incluindo limitação de ciclos (≤18 ciclos) e enzimas de alta fidelidade. Quando a truncagem do CDR3 excede 10%, a solução envolve otimização de códons seguida de validação de dobramento de proteínas in silico. Cada via contém intervenções técnicas específicas que alimentam a reavaliação da qualidade até que os problemas sejam resolvidos.
  • Métricas de Validação Diagnóstica:
    • Resolução de mudança de tamanho: Bioanalyzer DV200 >85%
    • Melhoria da complexidade: Taxa de duplicação pós-correção <15%
    • Recuperação de CDR3: Sequências completas >95%

Esta abordagem de diagnóstico em camadas permite a resolução rápida de falhas na preparação de bibliotecas de NGS, mantendo a integridade do pipeline de descoberta de anticorpos.

Visão geral da estratégia para gerar anticorpos a partir de bibliotecas de scFv sequenciadas em profundidade (Nannini F et al., 2021)

Soluções Inovadoras para Desafios Técnicos Chave

1. Eliminação da Interferência de Mutação Sinónima

• Estratégia Principal: Estabelecer linhas de base de frequência de códons utilizando bases de dados de referência.
  • Referência Principal: Base de Dados de Uso de Códons de Kazusa
  • Métrica de Desvio:
    Índice de Desvio de Mutação = Teórico / Frequência Observada
  • Limite: Desvios >2.0 indicam mutações não aleatórias.
• Filtro de Bioinformática Aprimorado:

2. Metodologia de Filtragem de Desvio de Uso de Códons

• Objetivo do Algoritmo: Identificar mutações sinónimas não aleatórias comparando as frequências de códons observadas com valores de referência específicos da espécie.
• Procedimento Computacional:
  • Carregamento de Dados de Referência: Importar as frequências de códons esperadas da base de dados Kazusa E. coli (e_coli_kazusa.csv)
  • Cálculo do Índice de Desvio:
    Para cada mutação: Índice de Desvio (ID) = Frequência Esperada / Frequência Observada
  • Triagem de Mutações Significativas: Manter variantes onde DI > 2.0 limiar
• Justificação Biológica:
  • As mutações sinónimas refletem tipicamente a deriva genética aleatória.
  • DI > 2.0 indica uma pressão de seleção funcional potencial.
  • Filtra eficazmente as variações neutras das mutações que aumentam a afinidade.
• Parâmetros Chave:

• DataFrame contendo apenas mutações com DI > 2.0, pronto para análise de maturação de afinidade a montante.

Este filtro computacional melhora significativamente a relação sinal-ruído em estudos de otimização de anticorpos ao excluir alterações sinónimas aleatórias, preservando ao mesmo tempo mutações funcionalmente relevantes.

Caso de Aplicação: Considerações Chave para a Construção de Bibliotecas de NGS de Exibição de Fagos

1. Materiais Experimentais

• Tipos de Bibliotecas:
  • Ph.D.-7: Heptapéptido linear (A-X7-GGGS)
  • Doutoramento-12: Dodecapeptídeo linear (A-X12-GGGS)
  • Ph.D.-C7C: Heptapeptídeo cíclico com restrições (AC-X7-CGGGS)
• Hospedeiro Bacteriano: Escherichia coli ER2738
• Plataforma de Sequenciamento: Illumina MiSeq (modo de extremidade única)

2. Preparação da Biblioteca de NGS

• Amplificação por PCR:
  • Primers: Sequências de adaptadores Illumina incorporadas
    • 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTTCCTTTAGTGGTACCTTCTCTATTCTC*
    • 5'-C*TTTCAACAAATGCTTTAGGGATCTGAGCATGCCGTCAGCTGCTGAACTG-3'
  • Termociclagem: Desnaturação inicial a 98°C durante 30 seg; 25 ciclos de [98°C durante 20 seg → 60°C durante 30 seg → 72°C durante 20 seg]
• Purificação: Kit de Purificação QIAquick PCR

3. Inovações em Análise de Dados

• Pipeline de Scripting Personalizado:
  • Função MATLAB: Traduzir sequências brutas em aminoácidos, filtrar peptídeos inválidos (que contêm códon de paragem '*').
  • Script Python 1: Eliminou sequências contaminantes entre bibliotecas.
  • Script Python 2: Corrigidos artefatos de má classificação de sobreposição de leituras nas bibliotecas Ph.D.-7 e Ph.D.-12.
  • Script Python 3: Identificou contaminantes de fago do tipo selvagem (clones WT).
• Algoritmo do Fator de Enriquecimento (EF):
  • EF = (Frequência_atual / Frequência_anterior)
  • Apenas os clones que apresentavam EF > 1 (indicando domínio de propagação) foram submetidos a uma análise mais aprofundada.

4. Experimento de Controlo Não Competitivo

• Propagação Independente: Cada biblioteca infectou o ER2738 separadamente.
• Titulação: Contagens de placa em placas de LB/Tet/X-gal aos 0, 150 e 270 minutos.

5. Principais Conclusões e Implicações

• A Conformação do Peptídeo Impacta a Aptidão de Propagação:
  • Ambiente Competitivo: Ph.D.-7 (linear curto) > Ph.D.-12 > Ph.D.-C7C (cíclico).
  • Ambiente Não Competitivo: O Ph.D.-C7C proliferou mais rapidamente, indicando que a dinâmica populacional altera significativamente a aptidão dos clones.
• Vantagens Técnicas do NGS Demonstradas:
  • Quantificação precisa das mudanças na proporção da biblioteca (por exemplo, Ph.D.-7 aumentou de 9% para 57,1% em t=150 min).
  • Deteção dos níveis de contaminação de clones WT.
  • Identificação de clones de alto EF que possuem mutantes de rápida proliferação (por exemplo, dentro do Ph.D.-C7C).
• Consideração Experimental Crítica:
  • Viés de Triagem de Biblioteca Híbrida: A Dominância de Peptídeos Lineares Curtos pode Ocultar Ligantes Cíclicos de Peptídeos de Alta Afinidade.
  • Estratégias de Mitigação: Implementar amplificação em etapas (propagação inicial independente seguida de mistura) ou aplicar fatores de correção de viés de propagação.

6. Avanços Técnicos

• Estudo Pioneiro: Primeira análise de NGS da propagação competitiva em bibliotecas de peptídeos de múltiplas conformações, revelando o impacto da dinâmica populacional nos resultados de triagem.
• Recursos de Código Aberto: Scripts de análise em MATLAB/Python fornecidos (ver Material Suplementar).
• Inovação Analítica: O algoritmo EF supera as limitações da dependência da abundância absoluta tradicional.
• Orientações de Design Experimental: Futuros rastreios de bibliotecas híbridas devem integrar:
  • Compensação de Propagação: por exemplo, fatores de correção específicos da biblioteca.
  • Monitorização com NGS: Acompanhamento dinâmico em tempo real do crescimento de clones (Kamstrup Sell D et al., 2023).

Diversidade do pool de fagos (Kamstrup Sell D et al., 2023)

Conclusão: Avançando para a Engenharia de Anticorpos 4.0

Sequenciação profunda as tecnologias, exemplificadas por plataformas como a Illumina, sofreram uma transformação fundamental. O seu papel evoluiu além de meras ferramentas de controlo de qualidade para se tornarem motores indispensáveis que impulsionam o design de anticorpos de novo. Esta mudança de paradigma é sustentada por avanços chave:

• Superando Barreiras de Throughput: Instrumentos como o NovaSeq™ x Plus alcançam capacidades de corrida única sem precedentes (16 TB), resolvendo efetivamente complexidades de bibliotecas de até 10¹³ clones.
• Ecossistemas de Análise Inteligente: Plataformas integradas como o BaseSpace™ Suite aceleram dramaticamente o processamento de dados, convertendo dados de sequenciação offline brutos em relatórios clínicos acionáveis em até 72 horas. Além disso, a triagem CRISPR-Cas9 permite a verificação direta e síncrona que liga a função fenotípica à sequência genotípica.
• Tecnologias Emergentes de Fronteira: Os desenvolvimentos futuros apresentam uma promessa imensa:
  • Sequenciação in situ: Permitir a leitura direta de sequências de peptídeos exibidas diretamente da superfície da partícula de fago.
  • Design assistido por computação quântica: Modelação do vasto espaço combinatório (milhares de milhões de conformações) dentro dos laços da Região Determinante de Complementaridade (CDR) de anticorpos para otimização preditiva.

A profunda integração de bioinformáticaA inteligência artificial e a síntese automatizada estão agora a catalisar uma revolução. O sequenciamento profundo de bibliotecas de exibição de fagos está na vanguarda, conduzindo o desenvolvimento de fármacos anticorpos para um ciclo inteligente e iterativo de "Projetar-Construir-Testar-Aprender" (DBTL). Isto representa o paradigma central da Engenharia de Anticorpos 4.0.

Para mais informações sobre o que é o sequenciamento de fagos, consulte "O Que É Sequenciação de Fagos? Um Guia Completo para Investigadores.

Mais métodos de sequenciação NGS de fagos estão disponíveis para referência.Sequenciação de Nova Geração para Análise de Fagos: Uma Abordagem Moderna.

As pessoas também perguntam

O que são bibliotecas de exibição de fagos?

As bibliotecas de exibição de fágios são coleções de fágios geneticamente modificados (vírus que infectam bactérias) que exibem uma ampla variedade de peptídeos, proteínas ou outras moléculas na sua superfície.

Quais são os diferentes tipos de exibição de fago?

A exibição de fagos tem vários tipos, incluindo exibição de peptídeos, exibição de proteínas e exibição de anticorpos (como scFv e Fab), que são utilizados para rastrear diferentes moléculas e anticorpos, respetivamente.

O que é o panning de biblioteca?

Na sua forma mais simples, a panagem é realizada incubando uma biblioteca de peptídeos exibidos por fago com uma placa (ou esfera) revestida com o alvo, lavando os fagos não ligados e eluindo os fagos especificamente ligados.

Referências:

1. Sloth AB, Bakhshinejad B, Stavnsbjerg C, Rossing M, Kjaer A. "A Profundidade de Sequenciamento Tem um Papel Determinante na Caracterização de Bibliotecas de Peptídeos por Exibição de Fagos através de NGS." Int J Mol Sci. 2023 Mar 11;24(6):5396. doi: 10.3390/ijms24065396
2. Georgieva Y, Konthur Z. "Design e triagem de bibliotecas cDNA de exibição de fago M13." Moléculas. 2011 Fev 17;16(2):1667-81. doi: 10.3390/molecules16021667
3. Plessers S, Van Deuren V, Lavigne R, Robben J. "Sequenciação de Alto Débito de Bibliotecas de Exibição de Fagos Revela Enriquecimento Parasitário de Mutantes Indel Causado por Viés de Amplificação." Int J Mol Sci. 24 de maio de 2021;22(11):5513. doi: 10.3390/ijms22115513
4. Ledsgaard L, Ljungars A, Rimbault C, Sørensen CV, Tulika T, Wade J, Wouters Y, McCafferty J, Laustsen AH. "Avanços na tecnologia de exibição de fagos de anticorpos." Descoberta de Fármacos Hoje. 2022 Ago;27(8):2151-2169. doi: 10.1016/j.drudis.2022.05.002
5. Kamstrup Sell D, Sinkjaer AW, Bakhshinejad B, Kjaer A. "A Capacidade de Propagação de Bibliotecas de Peptídeos em Exibição por Fago é Afetada pelo Comprimento e Conformação do Peptídeo Exibido." Moléculas. 2023 Jul 10;28(14):5318. doi: 10.3390/molecules28145318
6. Lindner T, Kolmar H, Haberkorn U, Mier W. "Bibliotecas de ADN para a construção de bibliotecas de fago: requisitos estatísticos e estruturais e métodos sintéticos." Moléculas2011 Fev 15;16(2):1625-41. doi: 10.3390/molecules16021625
7. Tsoumpeli MT, Gray A, Parsons AL, Spiliotopoulos A, Owen JP, Bishop K, Maddison BC, Gough KC. "Um Método Simples de PCR de Plasmídeo Inteiro para Construir Bibliotecas de Exibição de Fagos Sintéticos de Alta Diversidade." Mol Biotecnol. Jul 2022;64(7):791-803. doi: 10.1007/s12033-021-00442-4
8. Nannini F, Senicar L, Parekh F, Kong KJ, Kinna A, Bughda R, Sillibourne J, Hu X, Ma B, Bai Y, Ferrari M, Pule MA, Onuoha SC. "Combinação de exibição de fago com sequenciação de próxima geração SMRTbell para a descoberta rápida de fragmentos scFv funcionais." MAbs. 2021 Jan-Dez;13(1):1864084. doi: 10.1080/19420862.2020.1864084