O que é DAP-Seq?

Sequenciação por Purificação de Afinidade de DNA (DAP-seq) é uma tecnologia de sequenciação epigenómica que surgiu no campo da investigação de plantas nos últimos anos, capaz de se concentrar numa proteína (por exemplo, várias proteínas de fatores de transcrição envolvidas na transcrição de genes), estudar as sequências de DNA às quais essas proteínas estão ligadas, analisar as características de ligação e identificar o padrão de ligação das proteínas para direcionar os genes que são regulados por essas proteínas. A maior vantagem da tecnologia DAP-seq é que utiliza a expressão in vitro de proteínas marcadas para ligar o produto de expressão à sequência do genoma alvo, evitando perfeitamente o dilema da falta de anticorpos de proteínas que o campo da investigação de plantas enfrentou durante muito tempo no passado.

Vantagens da Tecnologia DAP-seq

Sequenciação por Purificação de Afinidade de DNA (DAP-seq) representa um avanço contemporâneo na exploração de locais regulatórios transcricionais, tendo ganho destaque nos últimos anos. Esta abordagem inovadora envolve o uso de construções in vitro para expressar proteínas de fatores de transcrição (TF). Essas proteínas ligam-se seletivamente a fragmentos genómicos alvo, permitindo a sequenciação de fragmentos de genes ligados a proteínas para a subsequente construção de bibliotecas e análise de sequências de ligação de TF.

A chegada da tecnologia DAP-seq aborda limitações históricas associadas à escassez de anticorpos de TF e eficiência de ligação subótima. Ao superar essas restrições, o DAP-seq amplia significativamente os horizontes da investigação de fatores TF. Esta tecnologia transformadora não apenas resolve desafios passados, mas também facilita uma exploração mais ampla e nuançada da dinâmica dos fatores de transcrição, marcando um avanço substancial no campo.

Visão Geral do Processo Experimental DAP-seq

• Preparação Preliminar

(1) Avaliação de Viabilidade: Inicie o processo fornecendo a sequência CDS do fator de transcrição para avaliação.

(2) Preparação de Amostras: Assegure um fornecimento adequado de amostras, seguindo as diretrizes descritas nas Diretrizes de Entrega de Amostras. Além disso, inclua plasmídeos contendo os fatores de transcrição alvo, suportados pelos resultados de sequenciação fornecidos.

(3) Duplicação de Amostras: Evite configurar amostras duplicadas para o mesmo fator de transcrição. Se a duplicação for necessária, é aconselhável estabelecer de duas a três amostras duplicadas e realizar o experimento de duplicação simultaneamente.

(4) Preparação de Informação Analisada: Reúna informações genómicas maduras, incluindo arquivo fa genómico, arquivo gff e arquivo pep.fa, adaptados à espécie em investigação.

Observações: Embora teoricamente todos os fatores de transcrição de plantas possam passar por DAP-seq, também é considerada a viabilidade de amostras não vegetais. No entanto, uma vez que o DAP é projetado principalmente para sistemas de expressão em plantas, os resultados subsequentes para amostras não vegetais não são garantidos. É importante notar que proteínas que não são fatores de transcrição não podem passar por análise de viabilidade, e a confiabilidade dos resultados subsequentes não é assegurada.

• Passos Específicos

Os passos principais abrangem construção de biblioteca de DNA, expressão de proteínas, reações de ligação entre a proteína e a biblioteca, PCR da biblioteca com splicing e detecção quantitativa, sequenciação online e análise de dados brutos.

(1) Extração de DNA Genómico Total e Construção de Biblioteca:

- Comece extraindo o DNA genómico total do material do tecido.

- Subsequentemente, construa a biblioteca de DNA.

(2) Construção de Plasmídeo de Expressão In Vitro para Fatores de Transcrição

- Desenvolva o plasmídeo de expressão in vitro Halo-tag para fatores de transcrição.

- Utilize o sistema de embrião de trigo para a expressão de proteínas.

(3) Interação e Enriquecimento da Proteína-Biblioteca

- Combine a proteína e a biblioteca.

- Utilize esferas magnéticas para enriquecer fragmentos de DNA ligados à proteína alvo.

(4) Lavagem e Purificação do Complexo

- Realize múltiplas lavagens para eliminar a cromatina ligada de forma não específica.

- Purifique o complexo resultante.

(5) Purificação de Fragmentos de DNA, Sequenciação e Análise de Dados Brutos

- Purifique os fragmentos de DNA.

- Realize a análise de sequenciação numa plataforma online.

- Analise os dados brutos de sequenciação para obter insights significativos.

Análise de Dados DAP-seq

• Controlo de Qualidade e Filtragem de Dados

O processamento inicial envolve controlo de qualidade e filtragem de dados brutos, abordando problemas de junção e eliminando dados de baixa qualidade.

O controlo de qualidade subsequente assegura a confiabilidade, examinando os dados limpos filtrados.

• Comparação da Sequência do Genoma de Referência

Utilizando dados limpos, realize uma comparação abrangente com a sequência do genoma de referência.

Identifique os locais genómicos onde as leituras sequenciadas estão mapeadas.

• Chamada de Picos e Geração de Arquivo Bam

Gere um arquivo bam após a comparação.

Utilize software para executar a chamada de picos no arquivo bam, identificando acumulações significativas de leituras que denotam locais de ligação dos fatores de transcrição estudados.

• Análise de Picos

Realize uma análise detalhada dos picos obtidos, considerando fatores como contagem de picos, comprimento, distribuição genómica e distribuição entre elementos funcionais do gene.

• Anotação Funcional e Análise de Enriquecimento

Aplique anotação GO e KEGG aos genes associados aos picos, desvendando suas funções.

Realize análise de enriquecimento para obter insights sobre a importância funcional desses genes.

Preveja fatores de transcrição de plantas e animais associados aos genes, fornecendo camadas adicionais de compreensão.

• Análise de Motivos

Um passo fundamental envolve a análise de motivos para identificar potenciais características de ligação dos fatores de transcrição.

Preveja motivos para aumentar a compreensão das características de ligação dos fatores de transcrição, facilitando a validação subsequente.

Fluxo de trabalho de bioinformática do DAP-Seq – CD Genomics

Análise Integrada de Transcriptoma e DAP-seq na Investigação de Plantas

No domínio das ciências das plantas, há um crescente interesse em combinar a análise de transcriptoma e a tecnologia DAP-seq para desvendar processos biológicos intrincados. Esta nova abordagem envolve a utilização do transcriptoma para identificar diferenciais genéticos intergrupos. Simultaneamente, o DAP-seq é empregado para examinar os genes específicos alvo dos fatores de transcrição, elucidando assim a rede regulatória abrangente.

Esta análise integrada oferece uma compreensão holística, ligando os alvos de ligação dos fatores de transcrição à emergência de genes diferencialmente expressos e suas distinções funcionais subsequentes. Experimentos biológicos subsequentes, como knockdown ou superexpressão de genes, servem como ferramentas de validação. Ao correlacionar dados dessas duas perspectivas genómicas, é alcançado um aprimoramento sinérgico na profundidade da pesquisa de transcriptoma. Esta abordagem abrangente fornece insights sobre a rede de expressão regulatória dos genes, iluminando seus mecanismos regulatórios a montante.

Por favor, consulte nosso artigo Como Usar DAP-Seq para Estudos de Fatores de Transcrição de Organismos Não Modelo? para um caso.

A conexão entre essas duas metodologias gira em torno das orientações dos fatores de transcrição e seus respectivos genes alvo.

• Identificação de Fatores de Transcrição

Fatores de transcrição funcionais frequentemente se manifestam em dados de RNA-seq, exibindo expressão diferencial entre amostras ou status de genes centrais dentro da rede regulatória de genes.

Fatores de transcrição que atendem a esses critérios tornam-se candidatos para investigação mais aprofundada e servem como alvos fundamentais para a subsequente construção de experimentos DAP-seq.

• Descoberta de Genes Alvo

As informações extraídas através do DAP-seq revelam as preferências de reconhecimento de sequência de DNA dos fatores de transcrição, expondo essencialmente potenciais locais de ligação.

Prever a relação regulatória entre fatores de transcrição e genes alvo é alcançável ao aproveitar esses potenciais locais de ligação.

A validação do impacto real dos genes alvo no fenótipo ocorre no nível transcricional e é realizada através de dados de RNA-seq.

A convergência de descobertas dessas duas metodologias frequentemente identifica o gene alvo final que contribui para o fenótipo observado, proporcionando uma compreensão abrangente da regulação transcricional.