O que é DAP-Seq?

Sequenciação por Purificação de Afinidade ao DNA (DAP-seq) é uma tecnologia de sequenciamento epigenómico que surgiu no campo da investigação em plantas nos últimos anos, capaz de se concentrar numa proteína (por exemplo, várias proteínas de fatores de transcrição envolvidas na transcrição génica), estudando as sequências de DNA às quais essas proteínas estão ligadas, analisando as características de ligação e identificando o padrão de ligação das proteínas para direcionar os genes que são regulados por essas proteínas. A maior vantagem da tecnologia DAP-seq é que utiliza a expressão in vitro de proteínas marcadas para ligar o produto de expressão à sequência do genoma alvo, o que evita perfeitamente o dilema da falta de anticorpos de proteínas que o campo da investigação em plantas tem enfrentado durante muito tempo no passado.

Vantagens da Tecnologia DAP-seq

Sequenciação por Purificação de Afinidade ao DNA (DAP-seq) representa um avanço contemporâneo na exploração de locais regulatórios de transcrição, tendo ganho destaque nos últimos anos. Esta abordagem inovadora envolve o uso de construções in vitro para a expressão de proteínas de fatores de transcrição (TF). Estas proteínas ligam-se seletivamente a fragmentos genómicos-alvo, permitindo o sequenciamento de fragmentos de genes ligados a proteínas para a construção de bibliotecas subsequente e análise de sequências de ligação de TF.

O advento de tecnologia DAP-seq aborda as limitações históricas associadas à escassez de anticorpos de fatores de transcrição (TF) e à eficiência de ligação subótima. Ao superar essas restrições, o DAP-seq amplia significativamente os horizontes da pesquisa sobre fatores de transcrição. Esta tecnologia transformadora não apenas resolve desafios passados, mas também facilita uma exploração mais ampla e nuançada da dinâmica dos fatores de transcrição, marcando um avanço substancial no campo.

Visão Geral do Processo Experimental DAP-seq

• Preparação Preliminar

(1) Avaliação de Viabilidade: Inicie o processo fornecendo a sequência CDS do fator de transcrição para avaliação.

(2) Preparação de Amostras: Assegure um fornecimento adequado de amostras, seguindo as diretrizes descritas nas Diretrizes de Entrega de Amostras. Além disso, inclua plasmídeos contendo os fatores de transcrição alvo, suportados pelos resultados de sequenciação fornecidos.

(3) Duplicação de Amostras: Evite configurar amostras duplicadas para o mesmo fator de transcrição. Se a duplicação for necessária, é aconselhável estabelecer duas a três amostras duplicadas e realizar o experimento de duplicação simultaneamente.

(4) Preparação da Informação Analisada: Reunir informação genómica madura, incluindo ficheiro fa genómico, ficheiro gff e ficheiro pep.fa, adaptados à espécie em investigação.

Observações: Embora, teoricamente, todos os fatores de transcrição das plantas possam passar por DAP-seqA viabilidade de amostras não vegetais também é considerada. No entanto, uma vez que o DAP é principalmente concebido para sistemas de expressão em plantas, os resultados subsequentes para amostras não vegetais não são garantidos. É importante notar que proteínas que não são fatores de transcrição não podem passar por uma análise de viabilidade, e a fiabilidade dos resultados subsequentes não está assegurada.

• Passos Específicos

Os passos principais abrangem Construção de biblioteca de ADNexpressão de proteínas, reações de ligação entre a proteína e a biblioteca, PCR da biblioteca com splicing e deteção quantitativa, sequenciação online e análise de dados brutos.

(1) Extração de DNA Genómico Total e Construção de Bibliotecas:

- Comece por extrair o DNA genómico completo do material tecidual.

- Em seguida, construa a biblioteca de ADN.

Construção de Plasmídeos de Expressão In Vitro para Fatores de Transcrição

- Desenvolver o plasmídeo de expressão in vitro com Halo-tag para fatores de transcrição.

- Utilize o sistema de embrião de trigo para a expressão de proteínas.

Interacção e Enriquecimento da Biblioteca de Proteínas

- Combine a proteína e a biblioteca.

- Utilize esferas magnéticas para enriquecer fragmentos de ADN ligados à proteína alvo.

(4) Lavagem e Purificação Complexa

- Realize múltiplas lavagens para eliminar o cromatina ligada de forma não específica.

- Purifique o complexo resultante.

(5) Purificação de Fragmentos de DNA, Sequenciação e Análise de Dados Brutos

- Purificar fragmentos de ADN.

- Realizar análise de sequenciamento numa plataforma online.

- Analisar dados de sequenciação bruta em busca de informações significativas.

Análise de Dados DAP-seq

• Controlo de Qualidade e Filtragem de Dados

O processamento inicial envolve o controlo de qualidade e a filtragem de dados brutos, abordando questões conjuntas e eliminando dados de baixa qualidade.

O controlo de qualidade subsequente garante a fiabilidade ao analisar minuciosamente os dados limpos filtrados.

• Comparação de Sequências do Genoma de Referência

Utilizando dados limpos, realize uma comparação abrangente com a sequência do genoma de referência.

Identifique as localizações genómicas onde as leituras sequenciadas estão mapeadas.

• Chamada de Picos e Geração de Ficheiros Bam

Gere um arquivo bam após a comparação.

Utilize software para executar a chamada de picos no arquivo bam, identificando acumulações significativas de leituras que denotam locais de ligação dos fatores de transcrição estudados.

• Análise de Picos

Realize uma análise detalhada dos picos obtidos, considerando fatores como contagem de picos, comprimento, distribuição genómica e distribuição entre elementos funcionais dos genes.

• Anotação Funcional e Análise de Enriquecimento

Aplique a anotação GO e KEGG aos genes associados aos picos, desvendando as suas funções.

Realize uma análise de enriquecimento para obter informações sobre a importância funcional destes genes.

Prever fatores de transcrição de plantas e animais associados aos genes, proporcionando camadas adicionais de compreensão.

• Análise de Motivos

Um passo fundamental envolve a análise de motivos para identificar potenciais características de ligação de fatores de transcrição.

Prever motivos para melhorar a compreensão das características de ligação dos fatores de transcrição, facilitando a validação subsequente.

Fluxo de trabalho de bioinformática do DAP-Seq – CD Genomics

Análise Integrada do Transciptoma e DAP-seq na Pesquisa em Plantas

No âmbito das ciências das plantas, há um interesse crescente em combinar a análise do transcriptoma e Tecnologia DAP-seq desvendar processos biológicos intricados. Esta nova abordagem envolve a utilização do transcriptoma para identificar diferenciais genéticos entre grupos. Simultaneamente, DAP-seq é utilizado para examinar os genes específicos alvo dos fatores de transcrição, elucidando assim a rede regulatória abrangente.

Esta análise integrada oferece uma compreensão holística, ligando os alvos de ligação dos fatores de transcrição ao surgimento de genes expressos diferencialmente e às suas distinções funcionais subsequentes. Experimentos biológicos subsequentes, como a redução ou superexpressão de genes, servem como ferramentas de validação. Ao correlacionar dados destas duas perspetivas genómicas, é alcançada uma melhoria sinérgica na profundidade da investigação do transcriptoma. Esta abordagem abrangente fornece insights sobre a rede de expressão regulatória dos genes, iluminando os seus mecanismos regulatórios a montante.

Por favor, consulte o nosso artigo. Como Utilizar DAP-Seq para Estudos de Fatores de Transcrição em Organismos Não Modelo? para um caso.

A conexão entre estas duas metodologias gira em torno das orientações dos fatores de transcrição e dos seus respetivos genes-alvo.

• Identificação de Fatores de Transcrição

Os fatores de transcrição funcionais frequentemente se manifestam em dados de RNA-seq, exibindo expressão diferencial entre amostras ou estado do gene central dentro da rede regulatória gênica.

Os fatores de transcrição que atendem a estes critérios tornam-se candidatos para investigação mais aprofundada e servem como alvos fundamentais para subsequentes. DAP-seq construção de experimento.

• Descoberta de Genes Alvo

A informação extraída através do DAP-seq revela as preferências de reconhecimento da sequência de DNA dos fatores de transcrição, expondo essencialmente potenciais locais de ligação.

Prever a relação regulatória entre fatores de transcrição e genes-alvo é possível ao aproveitar estes potenciais locais de ligação.

A validação do impacto real dos genes-alvo no fenótipo ocorre a nível transcricional e é realizada através de dados de RNA-seq.

A convergência dos resultados destas duas metodologias frequentemente identifica o gene-alvo final que contribui para o fenótipo observado, proporcionando uma compreensão abrangente da regulação transcricional.