Deteção de Plasmídeos e Sequenciação Completa de DNA de Plasmídeos

Introdução ao Plasmídeo Bacteriano

Os plasmídeos bacterianos são moléculas de ADN de dupla hélice, circulares ou lineares, definidas pela sua capacidade de replicação autónoma nos hospedeiros. Eles são fontes críticas para a evolução microbiana e inovação genómica devido à sua capacidade de adquirir sequências de ADN estrangeiro e transferir entre bactérias e entre organismos distantes, como a transferência de bactérias para eucariotos através de conjugação e mobilização. Os plasmídeos bacterianos sofrem uma frequência mais elevada de recombinação genética do que os cromossomas. O genoma do plasmídeo, também conhecido como genoma acessório ou flexível, não codifica funções básicas de sobrevivência, mas, em vez disso, contribui para a exploração de nichos ambientais específicos, patogenicidade, degradação de aromáticos e resistência a antimicrobianos (RAM). A resistência a antibióticos aumentou direta e acentuadamente o número de bactérias multirresistentes. Assim, considerável esforço tem sido feito para a deteção e monitorização de plasmídeos através de métodos como sequenciação completa de DNA plasmidial.

Figura 1. Replicação autónoma e integração genómica de plasmídeos bacterianos.

Métodos de Detecção de Plasmídeos

A deteção de plasmídeos é uma técnica fundamental amplamente utilizada na investigação em biologia molecular. O seu principal objetivo é determinar a presença, o tamanho e a pureza dos plasmídeos, componentes essenciais em estudos de engenharia genética e biologia molecular. As metodologias de deteção de plasmídeos abrangem uma variedade de abordagens, incluindo, mas não se limitando a, amplificação por PCR, eletroforese em gel, coloração por fluorescência, mapeamento óptico e sequenciação.

Tipagem de replicão baseada em PCR: Esta abordagem visa os locais de replicon conservados do plasmídeo, e a PCR multiplex pode ser expandida para direcionar simultaneamente muitos replicons. Embora seja barata e rápida, esta abordagem é difícil de abranger todos os novos grupos de plasmídeos.

Eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE): Este método separa o DNA digerido numa matriz de gel ao aplicar um campo elétrico que muda periodicamente de direção. No entanto, normalmente leva vários dias para revelar o tamanho e o número de plasmídeos em um isolado.

Figura 2. Eletroforese em gel com campo pulsado (Hu & Manos 2015)

Mapeamento óptico de plasmídeos: Este método que se baseia na extensão do ADN plasmidial pode ser utilizado para representar a sequência de um plasmídeo. No entanto, o mapeamento óptico pode não ser adequado para a deteção de plasmídeos curtos (< 50 Kb).

Figura 3. Mapeamento óptico de plasmídeos (Bogas et al., 2017).

Espectrofotometria UV: A espectrofotometria UV, uma técnica amplamente utilizada, serve para determinar a concentração e pureza de amostras de ácidos nucleicos, incluindo DNA plasmídico. Os ácidos nucleicos absorvem luz UV em torno de 260 nm. Ao medir a absorbância nesta comprimento de onda, a concentração de DNA na solução pode ser determinada com precisão.

Digestão com Enzimas de Restrição: A digestão de plasmídeos com enzimas de restrição é um passo fundamental, onde o padrão de clivagem esperado da enzima é utilizado para confirmar a presença e o tamanho dos plasmídeos.

Coloração por Fluorescência: A utilização de corantes fluorescentes como o SYBR Green permite a visualização e quantificação de plasmídeos através da deteção dos seus sinais de fluorescência.

Deteção de plasmídeos baseada em sequenciação: Com o desenvolvimento de tecnologias de sequenciação de alto rendimento, é possível obter toda a informação contida em plasmídeos. Sequenciação do genoma completo (WGS) pode capturar tanto dados de sequências bacterianas como de plasmídeos. Usando algoritmos como PlasmidSeeker e plasmidSPAdes, é possível extrair e montar dados de plasmídeos a partir de projetos de WGS. No entanto, estas ferramentas só conseguem detetar sequências de plasmídeos conhecidas a partir de dados brutos de WGS. Para analisar plasmídeos de forma abrangente, sequenciação completa de DNA plasmidial fornece uma ferramenta poderosa para obter a sequência completa do plasmídeo.

O que é o sequenciamento completo de DNA plasmidial?

Sequenciação Completa de DNA Plasmídico, também conhecido como Sequenciação de Plasmídeo Completo ou Sequenciação de Plasmídeo Total, refere-se ao processo de determinar e analisar toda a sequência de DNA de um plasmídeo. Este método de sequenciação permite uma visão abrangente da configuração completa do plasmídeo, incorporando genes, primers, promotores e outras sequências críticas que ele pode conter. Aproveitando as capacidades de Sequenciação de Nova Geração (NGS), Sequenciação PacBioou Sequenciação por nanoporo, permite o sequenciamento de todas as sequências de nucleótidos dentro de qualquer plasmídeo dado. Esta abordagem facilita uma caracterização abrangente de plasmídeos desconhecidos e uma verificação minuciosa dos conhecidos. Notavelmente, este método não requer primers nem depende de uma base de dados de referência.

O papel de Sequenciação Completa de DNA Plasmídico:

Verificação da Integridade da Sequência: Durante o processo de clonagem ou amplificação, os plasmídeos podem sofrer modificações genéticas, levando potencialmente a erros de sequência indesejados ou mutações.

Controlo de Qualidade em Clonagem e Engenharia: O sequenciamento de plasmídeos serve como um passo de controlo de qualidade, substanciando a precisão dos inseridos clonados, confirmando a ausência de mutações indesejadas e garantindo a integridade do sistema experimental.

Otimização do Desenho Experimental: O conhecimento preciso da sequência de um plasmídeo permite que os investigadores planeiem experiências de forma mais eficiente. A compreensão total da composição de um plasmídeo fornece insights fundamentais que podem orientar manipulações projetadas e prever os seus possíveis resultados.

Figura 4. Diagrama de círculo do plasmídeo

Processo de Sequenciação Completa de DNA de Plasmídeo

O fluxo de trabalho para o sequenciamento completo de plasmídeos inclui preparação de DNA plasmídico e controlo de qualidade (QC), construção de bibliotecas e QC, sequenciação e análise bioinformática (incluindo QC de dados, montagem de novo e análise adicional). Para NGS, é difícil alcançar montagens contíguas de plasmídeos, uma vez que o comprimento das leituras, tipicamente inferior a ∼400 a 500 bp, não consegue cobrir o comprimento total da maioria dos elementos genéticos móveis. Assim, as montagens de plasmídeos a partir de dados de NGS são frequentemente fragmentadas ou incompletas. A sequenciação de terceira geração, também conhecida como sequenciação de leituras longas, inclui sequenciação PacBio e Nanopore, proporcionando sequenciação rápida de plasmídeos e permitindo a montagem completa de plasmídeos em muitos casos. As principais vantagens de empregar Sequenciação de Nova Geração (NGS) a sequenciação completa de plasmídeos residem na sua precisão superior e nas suas capacidades de alto rendimento. Por outro lado, os principais benefícios de Tecnologia de nanoporo são manifestados no seu desempenho ótimo com alto conteúdo de GC e estruturas de Repetição Terminal Invertida (ITR). Atributos adicionais incluem extensos comprimentos de leitura e tempos de resposta reduzidos.

Várias precauções devem ser tomadas durante o Sequenciamento Completo de DNA Plasmídico:

• Empregue métodos de extração adequados e kits de extração de DNA plasmídico para evitar contaminação e degradação. Subsequentemente, deve ser realizada uma medição precisa da concentração de DNA plasmídico utilizando métodos colorimétricos ou fluorescentes, garantindo a utilização de quantidades idênticas de DNA em experimentos subsequentes.
• Com base nos requisitos experimentais e no tipo de amostras, deve ser selecionado o método de construção de biblioteca apropriado, como a amplificação por PCR ou o método de transposão. Ao utilizar a amplificação por PCR, as condições de PCR devem ser otimizadas para prevenir viés de amplificação e a introdução de produtos híbridos, garantindo assim um comprimento uniforme dos fragmentos de DNA plasmidial na biblioteca.
• O software de controlo de qualidade deve ser aplicado para filtrar e aparar os dados de sequenciação, eliminando leituras de baixa qualidade e sequências de adaptadores para melhorar a precisão da análise subsequente.
• Devem ser estabelecidos grupos de controlo adequados, incluindo controlos positivos, negativos e em branco. Isso garante a fiabilidade e a precisão dos resultados experimentais. A repetição de experiências fortalece a validação, aumentando assim a credibilidade dos resultados.

Aplicação do Sequenciamento Completo de DNA Plasmídico

Na engenharia genética e na pesquisa em biologia molecular, sequenciação completa de plasmídeos é utilizado para verificar a precisão e integridade das construções de plasmídeos. Através da análise de sequenciamento, pode-se afirmar a presença de sequências genéticas desejadas, promotores, etiquetas, etc., dentro do plasmídeo, garantindo assim a conformidade com as expectativas de design. No que diz respeito à pesquisa da função dos genes, o sequenciamento completo do plasmídeo pode iluminar as funcionalidades e mecanismos regulatórios dos genes dentro do plasmídeo. Ao analisar sequências de plasmídeos, podemos identificar os genes transportados pelo plasmídeo e aprofundar a nossa compreensão das funções desses genes, padrões de expressão e redes regulatórias dentro da célula.

Na investigação de doenças, sequenciação completa de plasmídeos é utilizado para identificar variações e mutações de plasmídeos associadas a doenças. Ao comparar sequências de plasmídeos de amostras de pacientes com amostras de controlo, podem ser identificados potenciais marcadores genéticos relacionados com o início e a progressão da doença. No que diz respeito ao desenvolvimento de medicamentos e terapias direcionadas, o sequenciamento completo de plasmídeos pode ajudar na identificação de potenciais alvos terapêuticos. Ao analisar os genes e elementos regulatórios dentro do plasmídeo, podem ser identificados novos alvos associados a doenças específicas, oferecendo novas direções para o design e desenvolvimento de medicamentos.

na área da investigação em microbiologia ambiental, o sequenciamento completo de plasmídeos serve como uma ferramenta valiosa para analisar a composição e a funcionalidade dos plasmídeos microbianos em amostras ambientais. Ao examinar o repertório de plasmídeos microbianos e as suas características funcionais, esta abordagem contribui para uma compreensão abrangente das características metabólicas microbianas, dos papéis ecológicos e das estratégias adaptativas em diversos contextos ambientais. Além disso, no domínio dos estudos genéticos, sequenciação completa de plasmídeos facilita a elucidação da diversidade genética de plasmídeos e das relações evolutivas entre diferentes espécies e populações. Isso ajuda a desvendar os papéis dos plasmídeos na transmissão genética e nos processos de adaptação das espécies, enriquecendo assim a nossa compreensão das dinâmicas evolutivas e dos mecanismos genéticos subjacentes às comunidades microbianas.

Sequenciação Completa de Plasmídeos e sequenciação Sanger

Sequenciação de Sanger e sequenciação completa de plasmídeos representam duas técnicas amplamente implementadas para sequenciação de DNA, cada uma oferecendo características únicas, mas mantendo uma relação integral entre si. A sequenciação de Sanger funciona principalmente com o método de terminação de cadeia, adaptado particularmente para sequenciar cadeias de DNA mais curtas, como genes específicos ou sequências de primers. Esta técnica também é útil na deteção de mutações genéticas específicas. Em termos de custo-efetividade, a sequenciação de Sanger oferece uma solução relativamente acessível, tornando-a adequada para projetos de sequenciação em menor escala.

Sequenciação completa de plasmídeos representa uma técnica sofisticada para sequenciar todo o DNA de um plasmídeo. Esta técnica aproveita principalmente o poder do sequenciamento de nova geração (NGS) ou sequenciamento de longas leituras para determinar a sequência do DNA plasmidial completo. Convencionalmente, o método de sequenciamento envolve a amplificação do DNA plasmidial através da reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida de sequenciamento de alto rendimento dos produtos amplificados, permitindo a recuperação da sequência completa do plasmídeo. Este método robusto é adequadamente adequado para uma ampla gama de aplicações que incluem a construção e validação de plasmídeos, pesquisa de doenças e estudos de microbiologia ambiental. Não obstante o custo relativamente elevado associado ao sequenciamento completo de plasmídeos, esta técnica facilita o acesso à sequência inteira de um plasmídeo, tornando-se uma ferramenta inestimável para projetos de sequenciamento expansivos que exigem análises abrangentes.

Enquanto tanto o sequenciamento Sanger quanto sequenciação completa de plasmídeos atendem à determinação de sequências de DNA e podem obter informações de sequências de DNA através de maquinaria de sequenciação, podem efetivamente complementar-se sob certas condições. Por exemplo, durante o processo de construção de plasmídeos, a sequenciação de Sanger pode ser utilizada para verificar regiões específicas do plasmídeo, enquanto a sequenciação completa do plasmídeo pode assegurar a totalidade e precisão do plasmídeo.

Referências:

1. Roosaare M, Puustusmaa M, Möls M, et al. PlasmidSeeker: identificação de plasmídeos conhecidos a partir de leituras de sequenciamento de genoma completo de bactérias. PeerJ, 2018, 6: e4588.
2. Gutiérrez-Barranquero J A, Cazorla F M, de Vicente A, et al. Sequência completa e análise genómica comparativa de oito plasmídeos nativos de Pseudomonas syringae pertencentes à família pPT23A. BMC Genomics, 2017, 18(1): 365.
3. Jackson R W, Vinatzer B, Arnold D L, et al. A influência do genoma acessório na evolução de patógenos bacterianos. Elementos genéticos móveis, 2011, 1(1): 55-65.
4. Bogas D, Nyberg L, Pacheco R, et al. Aplicações do mapeamento óptico de ADN na microbiologia. BioTécnicas, 2017, 62(6): 255-267.
5. Lemon J K, Khil P P, Frank K M, et al. Sequenciação rápida por nanoporo de plasmídeos e deteção de genes de resistência em isolados clínicos. Revista de Microbiologia Clínica, 2017, 55(12): 3530-3543.
6. Hu H, Manos J. Eletroforese em gel por campo pulsado de Pseudomonas aeruginosa//Eletroforese em Gel por Campo Pulsado. Humana Press, Nova Iorque, NY, 2015: 157-170.