Diretrizes para Submissão de Amostras
Perguntas e Respostas sobre Sequenciamento MeRIP
Perguntas Gerais
- O meRIP-seq pode estudar as modificações m6A do RNA?
- Absolutamente. Atualmente, as modificações m6A no RNA são principalmente estudadas por MeRIP-seq.
- Pode a m6A ser analisada em associação com RNA circ?
- Sim, podemos. Podemos construir uma biblioteca apenas para RNA circular, para coletar 5 µg de RNA circular para enriquecimento.
- É verdade que o m6A-seq não precisa de ter mais de 3 amostras por grupo, e é aceitável fazer m6A sem duplicados e apenas uma vez por amostra?
- Exceto para amostras de linhagens celulares, que podem ser feitas com apenas 2 réplicas (geralmente para dois métodos diferentes de shRNA ou siRNA), normalmente até as células primárias são três réplicas biológicas.
- Por que é que os genes do cloroplasto e da mitocôndria são comparados nos dados de MeRIP?
- A construção da biblioteca MeRIP é baseada na quantidade de mRNA para determinar o tipo de construção da biblioteca. Se os genes cloroplastidiais e mitocondriais estiverem correspondidos nos dados MeRIP, provavelmente é um problema de extração; não há uma boa maneira de remover mitocôndrias e cloroplastos, a única forma é aumentar o volume de sequenciação para aumentar os dados válidos.
- O MeRIP e o RIP são semelhantes?
- MeRIP (também conhecido como m6A-IP) e RIP diferem no sentido de que têm propósitos experimentais distintos: o primeiro detecta o nível de m6A de um gene, enquanto o último detecta o mRNA ligado a uma proteína de leitura. O anticorpo m6A pode teoricamente ligar-se a qualquer RNA com modificação m6A com 99% de especificidade e não há enriquecimento não específico.
- Como desenhar experimentos de MeRIP-seq?
- • Amostras: Células, tecidos, RNA total após extração (limitado a espécies com genoma de referência).
• Agrupamento: Modelo celular: grupo experimental e grupo de controlo, 3:3 recomendado.
• Tecidos: grupo normal e grupo de doença, 5:5 recomendado
• Controlo intra-grupo: grupo de IP e grupo de entrada
- • Amostras: Células, tecidos, RNA total após extração (limitado a espécies com genoma de referência).
- Preciso interromper após o enriquecimento de RNA na MeRIP-seq?
- É possível interromper ou não interromper. Se quiser interromper, por favor, certifique-se de que o alvo é apenas mRNA ou lncRNA antes de interromper. Se for apenas mRNA, pode usar esferas de oligo dT para enriquecer primeiro e depois interromper. Se tanto lncRNA quanto mRNA forem estudados, o rRNA do RNA total deve ser digerido com o kit antes da interrupção.
- Como eluir o RNA do anticorpo m6A se o meu volume de RNA for baixo?
- Se a quantidade inicial de RNA for baixa, o volume de eluição (buffer de eluição) pode ser aumentado em 25-30% e o número de eluições pode ser aumentado de 2 para 4-6 vezes.
- Como extrair o RNA após a IP?
- O RNA da IP pode ser extraído utilizando fenol:clorofórmio:álcool isoamílico numa proporção de volume de 25:24:1, ou adicionando diretamente o reagente Trizol.
- Qual é o seu processo de construção e sequenciação de bibliotecas MeRIP-seq?
- Cada conjunto de MeRIP-seq consiste em dois tipos de amostras, a amostra de imunoprecipitação (IP) e a amostra de controlo de Input. As moléculas de RNA são primeiro fragmentadas em fragmentos de 100-200nt. A amostra IP fornece uma medida não enviesada do fragmento de RNA metilado por meio de um anticorpo específico anti-m6A. Entretanto, a amostra de controlo de Input reflete a abundância do RNA base. A localização do m6A em todo o transcriptoma é determinada pela construção da biblioteca, sequenciação de alto rendimento e análise bioinformática.
- Que serviços de análise MeRIP-seq você oferece?
Análise Básica Análise Avançada Avaliação da qualidade dos dados de sequenciação Análise de expressão diferencial de genes metilados Controlo de qualidade Análise de enriquecimento da função GO de genes com metilação diferencial Análise da cobertura genética Análise de via KEGG de genes com metilação diferencial identificação de picos de m6A Análise de via reactome de genes com metilação diferencial anotação de características de picos m6A Análise de expressão diferencial de lncRNAs metilados análise de mRNA m6A Análise de enriquecimento funcional GO de genes cis-codificadores de lncRNAs diferencialmente metilados Análise de motivos de mRNAs metilados Análise de via KEGG de genes cis-codificadores de lncRNAs diferencialmente metilados análise de lncRNA m6A Análise de via Reactome de genes cis-encodificadores de lncRNAs diferencialmente metilados Análise de motivos de lncRNA metilados Análise de expressão diferencial de circRNAs metilados análise de reconhecimento e identificação de circRNA Análise de enriquecimento funcional GO de genes hospedeiros de circRNA diferencialmente metilados análise de enriquecimento de mRNA m6A de circRNA Análise de via KEGG de genes hospedeiros de circRNA diferencialmente metilados Análise de motivos de circRNA metilado Análise de via Reactome de genes hospedeiros de circRNA diferencialmente metilados
- Quais são as validações experimentais subsequentes do MeRIP-seq?
- MeRIP-qPCR. Após enriquecer o RNA com modificações de metilação utilizando anticorpo m6A, o próximo passo é quantificar o RNA enriquecido diretamente usando qPCR. Recomenda-se combinar com RT-qPCR de expressão génica, WB e outros meios de validação para verificar os resultados do teste.
- É necessário fazer MeRIP-seq além da sequenciação normal do transcriptoma?
- Não, os dados de entrada podem ser analisados normalmente. dados de sequenciação do transcriptoma completo.
- Por que é necessário fazer tanto amostras de Input como de IP para MeRIP-seq?
- Na configuração experimental do MeRIP-seq, o Input e o IP formam um par de amostras. As amostras IP são especificamente enriquecidas com anticorpos m6A para fragmentos de RNA modificados por metilação, enquanto o Input é apenas RNA fragmentado como controlo para reduzir o ruído de fundo, e a construção da biblioteca e a sequenciação são realizadas em paralelo. A análise combinada de deteção de picos requer a integração de dados de ambas as amostras e a utilização dos dados do Input para excluir picos com altos níveis de expressão de fundo ou ligação não específica, a fim de melhorar a precisão na identificação de picos.
- Há alguma restrição de espécies para realizar MeRIP-seq?
- Se não humanos, as espécies de ratos e camundongos são recomendadas para ser. consultado primeiro. Geralmente, espécies com genoma de referência, splicing do genoma ao nível do cromossoma e ficheiros de anotação gtf completos podem ser realizados; projetos eucariotos, procariotos ou virais são recomendados para avaliação inicial, uma vez que existem diferenças no software e nos parâmetros envolvidos na deteção de picos de ligação.
Preparação de Amostras
- Quais são os requisitos de entrega de amostras para MeRIP-seq?
- • Tipo de amostra: célula, tecido, RNA total
• MeRIP-seq convencional: RNA total ≥ 25 μg após digestão com Dnase, concentração ≥ 100 ng/μg, RIN ≥ 8.
• Outras espécies: RNA total ≥ 150 μg, concentração ≥ 100 ng/μg, RIN ≥ 8
- • Tipo de amostra: célula, tecido, RNA total
- É melhor usar RNA diretamente ou cDNA para MeRIP-seq?
- Após a extração do RNA total, coloque-o em água NF e armazene-o a -80°C durante pelo menos 2-4 semanas. Se a enriquecimento de mRNA for feito a partir do RNA total, por favor, realize o experimento imediatamente dentro de 2 dias, caso contrário, o mRNA será severamente degradado.
Quanto ao cDNA, se existir uma situação de transporte a longa distância, não é recomendável enviar RNA, ou enviar principalmente cDNA. Neste caso, pode-se fazer a transcrição reversa do produto a partir do Input e do IP e colocá-lo em água NF para transporte em gelo seco.
- Após a extração do RNA total, coloque-o em água NF e armazene-o a -80°C durante pelo menos 2-4 semanas. Se a enriquecimento de mRNA for feito a partir do RNA total, por favor, realize o experimento imediatamente dentro de 2 dias, caso contrário, o mRNA será severamente degradado.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
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