Sequenciação Genómica por Bisulfito (BSP-Seq) - Identificação de Metilação para ssDNA e dsDNA

Um dos principais mecanismos de modificação epigenética é Metilação do DNATem uma influência substancial na expressão génica que afeta diretamente a atividade celular. É um evento epigenético na modulação da impressão génica, desenvolvimento embrionário, diferenciação celular, inativação do X e proliferação celular. No entanto, a metilação anormal do DNA está comumente associada à instabilidade do DNA e do genoma, levando ao desenvolvimento de doenças como o câncer. Quando a metilação do DNA ocorre em certos genes relacionados ao câncer, pode levar ao silenciamento de genes supressores de tumores e à tumorigénese. Isso cria uma demanda crucial por métodos altamente sensíveis e fiáveis para explorar estratégias diagnósticas e terapêuticas inovadoras. Iluminar as regiões de metilação do DNA facilita a investigação do desenvolvimento celular, silenciamento transcricional e descoberta de biomarcadores.

Sequenciação genómica de bisulfito utiliza bisulfito de sódio para a conversão de DNA, o que revoluciona a análise de metilação do DNA. No entanto, o tratamento com bisulfito é um processo rigoroso que converte um DNA de dupla hélice estável em cadeias simples fragmentadas, com a maioria das citosinas convertidas em uracilo. Essas conversões levantam preocupações e ajustes na espectrofotometria UV, PCR e eletroforese em gel de agarose.

Figura 1. Conversão de bisulfito e sequenciação de amostras (Li, 2011)

A metilação numa cadeia de DNA pode ser detetada quando as citosinas não metiladas em DNA de cadeia simples são convertidas em resíduos de uracilo, que são reconhecidos como timina na amplificação subsequente por PCR. Por outro lado, as citosinas metiladas são imunes a esta conversão e permanecem como citosinas, permitindo distinguir as Cs metiladas das não metiladas. Determinar o estado de metilação nos loci de interesse requer uma reação de PCR subsequente utilizando primers específicos de metilação após o tratamento com bisulfito de sódio. O estado de metilação pode ser conhecido através da sequenciação direta do produto de PCR ou da sequenciação por sub-clonagem. No entanto, a sequenciação direta do produto de PCR geralmente produz qualidade inferior e pode confundir a quantificação; por isso, a clonagem seguida de sequenciação é recomendada. Além disso, a pirosequenciação pode ser utilizada como uma alternativa para a sequenciação direta por PCR.

A análise de sequenciação por bisulfito pode não só identificar a metilação ao longo da cadeia simples de DNA, mas também detectar os padrões de metilação nas cadeias duplas de DNA, uma vez que os produtos de amplificação podem ser medidos individualmente e as cadeias de DNA convertidas já não são auto-complementares. A Figura 1 mostra os principais destaques do processo de conversão do DNA. Um espectrofotómetro UV é utilizado para a quantificação do DNA convertido como RNA. Para a avaliação da qualidade, o DNA convertido será submetido a uma eletroforese em gel de agarose a 2%. As bandas aparecerão como manchas desde 1500 até 100 bp. Os primers de PCR de bisulfito são mais longos, enquanto os amplicons são mais curtos do que o normal. A Sequenciação de Bisulfito de Genoma Inteiro (WGBS) e a Sequenciação de Bisulfito de Representação Reduzida (RRBS) são as duas abordagens que podem ser utilizadas para avaliar a metilação do DNA utilizando NGS.

Referência:

1. Li, Y., Tollefsbol, T. O. Detecção de metilação de DNA: análise de sequenciação genómica com bisulfito. Métodos em biologia molecular, 2011, 791, 11–21.