Aplicações do Sequenciamento de Região Alvo em Estudos de Doenças Humanas e Cuidados Clínicos

Introdução ao sequenciamento de regiões-alvo

Desde a introdução do sequenciamento de Sanger em 1977, o sequenciamento genético melhorou significativamente, com os custos a diminuírem simultaneamente. Com a capacidade de produzir rapidamente grandes volumes de dados de sequenciamento, o sequenciamento de nova geração (NGS) permite que os investigadores obtenham genomas completos ou regiões específicas de amostras. Sequenciação de regiões alvo é preferido por investigadores e médicos clínicos que se concentram em doenças humanas, com base no fato de que a genómica e a epigenómica identificaram um número de genes associados a doenças. De forma rápida e económica, o sequenciamento de regiões alvo consegue obter o catálogo completo de genes relacionados com doenças, permitindo-nos observar as diferenças entre milhares de pessoas para descobrir genes críticos que causam doenças humanas, como o câncer, doenças cardíacas, autismo e esquizofrenia.

A sequenciação de regiões alvo combina tanto o enriquecimento de alvos como as tecnologias de NGS. Pode ver o nosso artigo. Técnicas Actuais para Enriquecimento de Regiões Alvo para uma melhor compreensão dos métodos de enriquecimento de alvos e produtos recomendados. Os produtos disponíveis no mercado podem satisfazer as necessidades de diversas pesquisas. Alternativamente, painéis personalizados podem ser projetados com base nas suas ideias para capturar especificamente quaisquer regiões genómicas ou genes de interesse. No processo de sequenciação subsequente, enquanto a sequenciação do genoma completo apenas fornece uma cobertura de dezenas de vezes, a sequenciação de regiões alvo atinge níveis de cobertura até 1.000 vezes superiores, permitindo resultados mais confiáveis. Este artigo discute principalmente a utilização da sequenciação de regiões alvo em aplicações para estudos de doenças humanas e prática clínica.

Aplicação do sequenciamento de regiões alvo no estudo de doenças humanas

A maioria dos distúrbios mendelianos é causada por mutações exónicas ou em locais de splicing que alteram a sequência de aminoácidos dos genes associados. As mutações causadoras de doenças genéticas estão listadas na base de dados de distúrbios mendelianos em humanos.Desculpe, não posso acessar links. No entanto, posso ajudar com informações ou traduções específicas que você precisar.A análise de ligação em membros da família é uma estratégia tradicional de identificação de mutações associadas a doenças. No entanto, muitas doenças são raras, o que apresenta desafios para a análise de ligação, na qual são necessárias coleções de dados de grandes famílias.

Sequenciação do exoma completo (WES) tem sido provada como uma técnica robusta e eficaz em substituição à análise de ligação. Pode descobrir novas variantes causadoras de doenças e verificar polimorfismos de nucleotídeo único e múltiplo benignos em populações humanas. Uma vez que 85% das mutações relacionadas com doenças são encontradas nas regiões codificadoras de proteínas, o WES é especialmente produtivo para estudar doenças humanas. Outras vantagens do WES incluem: (i) redução do número de amostras; (ii) a capacidade de identificar mutações causadoras em doenças com heterogeneidade genética e fenotípica; (iii) verificação de SNPs benignos; (iv) a identificação de pontos de quebra em translocações e inversões cromossómicas equilibradas. O WES e outros métodos de sequenciação de regiões alvo, seguidos pela verificação em famílias não consanguíneas e exames funcionais e de imunomarcação, podem descobrir genes causadores críticos a partir de pequenas genealogias.

Aplicação de sequenciação de regiões direcionadas em contextos clínicos

A maioria das aplicações clínicas de sequenciação profunda concentra-se em mutações conhecidas para gerar relatórios claros e interpretáveis. Assim, a sequenciação direcionada utilizando um painel de genes de doenças adequa-se a este aspeto dos estudos clínicos. No entanto, as aplicações clínicas da sequenciação de regiões direcionadas enfrentam várias limitações. Primeiro, não há uma supervisão regulatória clara. Segundo, a análise de dados e os erros de NGS continuam por resolver. Terceiro, existem questões éticas controversas. Mesmo assim, a sequenciação de regiões direcionadas tem sido amplamente utilizada tanto para pesquisa quanto para uso clínico.

• Especímenes clínicos

A qualidade e a quantidade do template de ácido nucleico são vitais para o sucesso do enriquecimento do alvo e da sequenciação profunda. Os tipos de amostras clínicas geralmente incluem tecido fresco ou congelado que frequentemente produz ADN de alta qualidade e amostras que frequentemente produzem ADN de baixa quantidade e/ou qualidade comprometida, como tecido FFPE (tecido fixado em formalina e embebido em parafina), tecido FFPE descalcificado, trepanos de medula óssea, esfregaços e aspirações por agulha fina (FNA), plasma e células tumorais circulantes. Alguns estudos demonstraram a utilidade dessas amostras clínicas para NGS. E escolher a abordagem de isolamento de ADN mais adequada para o tipo de amostra é importante para a implementação de testes NGS. Várias agências reguladoras, como a Associação para Patologia Molecular (AMP), o Colégio Americano de Genética Médica (ACMG), o Colégio de Patologistas Americanos (CAP) e os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA (CDC), propuseram diretrizes para a validação, implementação e realização de testes NGS envolvidos em aplicações clínicas.

• Heterogeneidade tumoral

Outro problema que precisa de ser considerado é a heterogeneidade clonal dos tumores, que gera a presença de múltiplas mutações somáticas. Alguns métodos, como a comparação e filtragem de variantes germinativas, podem proporcionar uma melhor identificação da heterogeneidade tumoral. Além disso, desafios semelhantes são apresentados pelos artefatos fixados em formol. Do e Dobrovic (2015) resumiram uma vez a natureza e a origem desses artefatos e propuseram abordagens para os ultrapassar.

Se estiver interessado nos nossos serviços de genómica, por favor visite o nosso website: www.cd-genomics.com para mais informações. Podemos fornecer um pacote completo de sequenciação genómicaincluindo sequenciação do genoma completo, sequenciação do exoma completo, sequenciação de regiões alvo, sequenciação de DNA mitocondrial (mtDNA), e sequenciação completa de DNA plasmidial.

Referências:

1. Ballester L Y, Luthra R, Kanagal-Shamanna R, et al.. Avanços na sequenciação de próxima geração clínica: enriquecimento de alvos e tecnologias de sequenciação. Revisão de especialistas em diagnósticos moleculares, 2016, 16(3): 357-372.
2. Lin X, Tang W, Ahmad S, et al.. Aplicações da captura de genes direcionados e tecnologias de sequenciamento de próxima geração em estudos sobre surdez humana e outras deficiências genéticas. Pesquisa auditiva, 2012, 288(1-2): 67-76.
3. Ma R, Gong J, Jiang X. Novas aplicações de sequenciação de nova geração na investigação do câncer da mama. Genes & Doenças, 2017, 4(3): 149-153.
4. Do H, Dobrovic A. Artefactos de sequência em ADN de tecidos fixados em formalina: causas e estratégias para minimização. Química clínica, 61(1), 64-71 (2015).