Técnicas Actuais para Enriquecimento de Regiões Alvo

O que é sequenciação de regiões alvo?

Enquanto sequenciação do genoma completo cobre todo o genoma de um organismo, sequenciação de região alvo determina a ordem dos nucleótidos nas regiões de interesse. Utilizando o sequenciamento genómico direcionado, é possível detetar SNPs, indels, CNVs e SVs grandes de forma altamente sensível e específica. Comparado com o sequenciamento do genoma completo, o sequenciamento genómico direcionado é mais focado, económico e eficaz. Além disso, as regiões direcionadas podem ser sequenciadas a uma profundidade muito maior por um custo inferior, o que contribui para a deteção de variações raras. O sequenciamento do exoma completo é um exemplo de sequenciamento genómico direcionado, uma vez que se concentra nos exões. E utilizando um painel direcionado ou de “hot-spot”, podemos sequenciar uma variedade de genes de interesse. Estes genes podem conter mutações associadas à patogénese de doenças, ou são genes clinicamente acionáveis de interesse. Isto tem sido aplicado à investigação biológica e médica, bem como aos cuidados clínicos. Aqui discutimos principalmente as técnicas atuais de enriquecimento de alvos e recomendamos produtos qualificados.

Técnicas clássicas para enriquecimento direcionado

O enriquecimento direcionado facilita grandemente o desenvolvimento de sequenciação de regiões alvo, tornando a sequenciação acessível e eficiente para genomas complexos. Existem três estratégias clássicas para o enriquecimento direcionado (Figura 1).

Figura 1. Estratégias para enriquecimento direcionado (Mertes) et al.. 2011). 1) Captura híbrida, seja em microarrays (a) ou em solução (b). 2) Enriquecimento por MIPs (a) ou sondas seletoras (b). 3) Enriquecimento por PCR típica (a), ensaio de PCR multiplex (b) e PCR em microgotas RainDance com até 20.000 pares de primers (c).

• Captura híbrida

A biblioteca de fragmentos de shotgun é preparada para hibridizar com uma biblioteca que contém fragmentos de DNA complementares às regiões-alvo. Isso pode ser realizado em microarrays ou em soluções. Mamanova et al.(2010) constatou que para tamanhos de alvo pequenos (aproximadamente 3,5 Mb), a captura em solução oferece uma cobertura superior das regiões-alvo em comparação com a abordagem baseada em array, e que para o enriquecimento do exoma completo, ambas as abordagens apresentam desempenho equivalente. Recomendamos SureSelect (Agilent Technologies), Nextera (Illumina), TruSeq (Illumina) e SeqCap EZ (Roche NimbleGen) para enriquecimento de alvos baseado em hibridização em solução.

• Circularização seletiva

As sondas de inversão molecular (MIPs) consistem numa sequência comum flanqueada por sequências específicas para o alvo. Após a hibridização às regiões de interesse, a MIP é sujeita a uma reação de preenchimento de lacunas e ligação para gerar círculos fechados. As MIPs podem ser hibridizadas a DNA cortado mecanicamente, enquanto as sondas seletoras utilizam um coquetel de enzimas de restrição para digerir o DNA e as sondas são adaptadas ao padrão de restrição. As MIPs e as seletoras consistem num ligador central comum, sendo que o primer de sequenciação para NGS pode ser incluído neste ligador. Portanto, a construção da biblioteca de NGS não é necessária. Recomendamos o HaloPlex (Agilent Technologies) para enriquecimento seletivo baseado em circularização.

• Amplificação por PCR

A PCR é utilizada para enriquecer regiões de interesse através da realização de múltiplas PCRs de longo alcance em paralelo, PCRs multiplex e PCRs em microgotas. Existem muitos produtos disponíveis para PCR de longo alcance, incluindo SequalPrep (Thermo Fisher Scientific) e SeqTarget (Qiagen), Ion Ampliseq baseado em PCR de alta multiplexação, e a tecnologia de microgotas da RainDance.

As comparações das técnicas clássicas de enriquecimento de alvos

As quatro estratégias têm os seus próprios méritos e deméritos. Por exemplo, a especificidade da PCR excede a da captura híbrida, mas a sua uniformidade não é igualada nem pelos MIPs nem pela captura híbrida. Para atualizações de protocolos, pode visitar este site: ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/pulldown/.

Tabela 1. Comparações de métodos de enriquecimento de alvos. Adaptado de Dapprich et al.. (2016).

Método avançado: Extração Específica da Região (EER)

Os métodos tradicionais dependem fortemente da fragmentação do DNA antes da amplificação, o que gera sequências relativamente curtas (menos de 1kb). Este é um fator limitante para a caracterização de loci genómicos complexos, uma vez que não conseguem fornecer fragmentos grandes o suficiente para abranger elementos de sequência confusos. Felizmente, o método de enriquecimento — Extração Específica de Região (RSE), proposto por Dapprich et al.(2016) aborda esta necessidade não satisfeita ao capturar longas fragmentos de DNA (aproximadamente 20kb).

O princípio da RSE está delineado na Figura 2. Resumidamente, o DNA genómico é desnaturado para ser hibridizado com primers de captura. Os primers ligados são então estendidos enzimaticamente com dNTPs biotinilados incorporados. Os segmentos de DNA alvo são capturados por partículas magnéticas revestidas com estreptavidina. O DNA capturado pode ser amplificado por amplificação do genoma completo e, posteriormente, processado por sequenciação de nova geração.

Figura 2. Princípio do RSE.

Métricas para a avaliação de um experimento de enriquecimento de alvos

Existem várias métricas que precisam ser consideradas em experiências de enriquecimento de alvos. Para lidar com esta questão, foi desenvolvido um conjunto universal de Descritores de Sequenciamento de Enriquecimento de Alvos (TESD), permitindo avaliar os resultados do enriquecimento de alvos. O TESD utiliza os seguintes parâmetros:

1. Região de interesse, ROI
2. Profundidade média de leitura na região de leitura, D_ROI
3. Especificidade, S
4. Fator de enriquecimento, FE
5. Uniformidade, E
6. Peso do requisito de DNA de entrada, W
7. Frações suficientemente cobertas a uma profundidade de leitura de x, F_x

Dos sete métricas, o ROI e o W determinam a necessidade de entrada, e as outras cinco são um relatório mensurável sobre a enriquecimento (S, EF, E) ou sobre os resultados de sequenciação (D)._ROI, F_x).

Se estiver interessado nos nossos serviços de genómica, por favor visite o nosso website: www.cd-genomics.com para mais informações. Podemos fornecer um pacote completo de sequenciação genómicaincluindo sequenciação do genoma completo, sequenciação do exoma completo, sequenciação de região alvo, sequenciação de DNA mitocondrial (mtDNA)e sequenciação completa de DNA plasmídico.

Referências:

1. Dapprich J, Ferriola D, Mackiewicz K, et al.A próxima geração de tecnologias de captura de alvos - enriquecimento e sequenciação de grandes fragmentos de DNA - determina a variação genómica regional de alta complexidade. BMC Genomics, 2016, 17(1): 486.
2. Mamanova L, Coffey A J, Scott C E, et al.Estratégias de enriquecimento de alvos para sequenciação de nova geração. Métodos da Natureza, 2010, 7(2): 111.
3. Mertes F, ElSharawy A, Sauer S, et al.Enriquecimento direcionado de regiões de DNA genómico para sequenciação de nova geração. Briefings em genómica funcional, 2011, 10(6): 374-386.
4. McGinn S, Bauer D, Brefort T, et al.Novas tecnologias para análise de DNA – uma revisão do Projeto READNA. Nova biotecnologia, 2016, 33(3): 311-330.
5. Ballester, L. Y., Luthra, R., Kanagal-Shamanna, R., et al. Avanços na sequenciação de próxima geração clínica: enriquecimento de alvos e tecnologias de sequenciação. Revisão Especializada em Diagnósticos Moleculares, 2016, 16(3), 357–372. doi:10.1586/14737159.2016.1133298