Diretrizes para Submissão de Amostras
Perguntas e Respostas sobre Transcriptómica
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Perguntas Gerais
- Quais tipos de sequenciação de transcriptoma podem ser escolhidos?
- (1) De acordo com o tipo de RNA
Existem sequenciação de mRNA, sequenciação de SmallRNA, sequenciação de LncRNA, sequenciação de CircRNA, sequenciação do transcriptoma completo, etc.
(2) De acordo com as características das espécies
Por exemplo, eucariotos ou procariotos, se existe um genoma de referência, diferentes plataformas de sequenciação, sequenciação do transcriptoma eucariota com e sem referência, sequenciação do transcriptoma procariota, sequenciação do transcriptoma de comprimento completo, etc.
- (1) De acordo com o tipo de RNA
- Como escolher o tamanho do volume de dados para sequenciação do transcriptoma?
- A quantidade de dados necessária para o sequenciamento regulatório transcricional varia dependendo do tipo de projeto, e a quantidade de dados também está relacionada ao tamanho e complexidade do genoma.
Para garantir a fiabilidade e a precisão dos resultados da análise de dados, para a plataforma Illumina e a plataforma PacBio: recomenda-se um volume de dados de 6Gb para sequenciação do transcriptoma eucariótico para análises subsequentes, e um volume de dados de 8-10Gb é recomendado.
Se quiser detetar transcritos com menor abundância; para o transcriptoma procariótico, recomenda-se um volume de dados de 4Gb para análises subsequentes; e para alguns genes com um elevado número de espécies, itens de preocupação com menor abundância de expressão génica e interacções patógeno-hospedeiro, o volume de dados pode ser aumentado de forma apropriada de acordo com a situação.
- A quantidade de dados necessária para o sequenciamento regulatório transcricional varia dependendo do tipo de projeto, e a quantidade de dados também está relacionada ao tamanho e complexidade do genoma.
- Qual é a diferença entre bibliotecas de transcriptoma procariótico e eucariótico?
- O mRNA eucariótico possui uma cauda poli-A e pode ser enriquecido por poli-dT. Além disso, os genomas eucarióticos são geralmente maiores e normalmente têm genes apenas na cadeia positiva, portanto, a construção de bibliotecas eucarióticas pode ser feita através do enriquecimento por poli-A.
Os genomas procarióticos têm uma taxa de utilização mais elevada e mais genes existem tanto nas fitas positiva como negativa, por isso precisamos distinguir entre a informação da fita positiva e da fita negativa na construção de bibliotecas procarióticas, e o nosso método de construção de bibliotecas procarióticas é a construção de bibliotecas específicas de fita ribossómica.
- O mRNA eucariótico possui uma cauda poli-A e pode ser enriquecido por poli-dT. Além disso, os genomas eucarióticos são geralmente maiores e normalmente têm genes apenas na cadeia positiva, portanto, a construção de bibliotecas eucarióticas pode ser feita através do enriquecimento por poli-A.
- Processo de construção de bibliotecas de transcriptoma de mRNA de rotina?
- 1. Extração de RNA total da amostra
2. Enriquecimento de RNA com estrutura de poli A na extremidade 3' utilizando esferas magnéticas Oligo(dT)
3. Transcrição reversa e construção de biblioteca de cDNA
4. PCR
Sequenciação PE250 de extremidade dupla baseada na plataforma Illumina NoveSeq 6000
- 1. Extração de RNA total da amostra
- Qual é a relação entre o sequenciamento do transcriptoma e a expressão gênica digital (DEG)?
- As principais diferenças entre o transcriptoma e os DEG são a estratégia de sequenciação, o volume de dados e a análise de dados. A sequenciação do transcriptoma tem um volume de dados maior e permite a análise da estrutura dos genes, além da análise de genes expressos diferencialmente. Em contraste, o volume de dados da sequenciação de DEG é pequeno, o que geralmente significa que pode satisfazer a análise de expressão gênica diferencial, mas não pode realizar a análise da estrutura dos genes.
- A sequenciação do transcriptoma requer replicados biológicos?
- Os organismos individuais são muito diferentes, e se o tamanho da amostra for pequeno, os genes diferencialmente expressos obtidos são provavelmente a expressão de apenas algumas diferenças individuais, e não refletem as características essenciais de uma doença ou de um estado fisiológico particular da população.
Para amostras de plantas e animais, recomenda-se mais de 5 réplicas biológicas para realizar testes de correlação entre amostras biológicas, a fim de melhorar a credibilidade dos resultados experimentais.
Para amostras celulares, a variabilidade entre réplicas biológicas é relativamente pequena, e são recomendadas mais de 3 réplicas biológicas.
Para amostras de estudos clínicos, são necessários mais réplicas biológicas devido a possíveis diferenças no genótipo, estilo de vida, ambiente de vida, idade e género dos dadores, sendo geralmente necessárias mais de 10 réplicas biológicas.
- Os organismos individuais são muito diferentes, e se o tamanho da amostra for pequeno, os genes diferencialmente expressos obtidos são provavelmente a expressão de apenas algumas diferenças individuais, e não refletem as características essenciais de uma doença ou de um estado fisiológico particular da população.
- Ao sequenciar o transcriptoma eucariótico, o RNA mitocondrial e o RNA cloroplastidial serão detetados?
- Normalmente não, porque os RNAs mitocondriais e de cloroplastos não têm caudas de poli-A.
- Posso fazer uma análise de transcriptoma procariótico ou uma análise de transcriptoma sem referência quando a espécie não tem um genoma de referência?
- Não, não é recomendado. O transcriptoma procariótico requer um genoma de referência porque os mRNAs dos procariontes são geralmente múltiplos cis-trans, e o splicing direto é menos eficaz e tem um grande impacto na análise de dados subsequente.
- No caso de um genoma de referência inadequado, devo optar por sequenciar o transcriptoma sem ou com referência?
- Desde que o genoma de referência esteja disponível, é preferencialmente recomendado utilizar o genoma de referência para a análise. A parte mais difícil da montagem do genoma é a região de repetição, e a má qualidade da montagem dos genes deve-se principalmente às sequências repetidas. As sequências das regiões codificantes do genoma são relativamente fáceis de montar porque apresentam boa heterozigosidade ou repetibilidade. A qualidade da montagem da região codificante é geralmente melhor. Portanto, o genoma de referência é utilizado preferencialmente.
- Quais são os fatores que afetam os resultados do sequenciamento do transcriptoma?
- A degradação do RNA afeta seriamente a qualidade do sequenciamento. Após a degradação do RNA, o mRNA purificado não pode ser capturado após a adição de poli-A, portanto, a transcrição reversa com primers aleatórios não consegue obter todos os cDNAs, resultando em um viés óbvio de 3' e 5' nos resultados do sequenciamento. A presença de polimorfismos de poli-A na biblioteca pode interferir com o sinal de sequenciamento e afetar a precisão dos resultados do sequenciamento; ao mesmo tempo, devido à abundância inconsistente de transcritos no transcriptoma, as amostras precisam ser homogeneizadas antes do experimento, caso contrário, os genes expressos em alta abundância irão mascarar os genes expressos em baixa abundância, resultando na falha em encontrar novos genes ou na obtenção de um grande número de sequências duplicadas sem significado.
- Por que é que preciso de construir uma biblioteca específica de fitas?
- Muitos genes têm transcrições de RNA de sentido positivo e negativo no genoma, e a transcrição antisense é uma característica dos genes eucarióticos e um modo importante de regulação. O uso de bibliotecas específicas de fita preserva a informação direcional do RNA e permite-nos determinar se as transcrições são de fitas positivas ou negativas, permitindo-nos obter resultados de caracterização genética e informações sobre a expressão gênica mais precisos.
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Preparação de Amostras
- Preciso congelar rapidamente a minha amostra celular após adicionar trizol à extração de RNA?
- O Trizol é um reagente para a extração de RNA total diretamente de células ou tecidos. O Trizol mantém a integridade do RNA durante a lise ou homogeneização da amostra; para garantir a integridade do RNA, este deve ser rapidamente congelado em azoto líquido e, em seguida, transferido para -80°C para congelamento (para armazenamento a longo prazo).
- São 20 mg de tecido adiposo suficientes para o transcriptoma?
- O tecido adiposo é uma amostra de tecido com baixo conteúdo de ácidos nucleicos e baixo rendimento de RNA. Em circunstâncias normais, 1 mg de tecido adiposo pode extrair apenas 0-0,05 μg de RNA, 20 mg de amostra podem extrair no máximo 1 μg de RNA se a amostra estiver em boas condições e sem considerar a perda na extração, enquanto normalmente são necessários 2 μg de RNA para sequenciamento de transcriptoma, recomenda-se enviar mais amostras, de preferência acima de 50 mg.
- Quais são as precauções a tomar durante a entrega de amostras de sangue para sequenciação do transcriptoma?
- Recomenda-se o uso de tubos de anticoagulação com EDTA para amostras de sangue total, ou tubos de anticoagulação com citrato de sódio também são aceitáveis. As células sanguíneas podem também ser centrifugadas, mas tanto o sangue total como as células sanguíneas devem ser tratados com Trizol. Após o congelamento rápido em nitrogênio líquido, armazenar a -80°C e transportar em gelo seco.
Para sangue humano total, recomenda-se o uso de tubos PAXgene para a colheita, que podem ser armazenados durante 3 dias a 18-25°C, 5 dias a 2-8°C e 8 anos a -20 a -80°C. Em princípio, é necessário o armazenamento a -80°C e o transporte em gelo seco.
- Recomenda-se o uso de tubos de anticoagulação com EDTA para amostras de sangue total, ou tubos de anticoagulação com citrato de sódio também são aceitáveis. As células sanguíneas podem também ser centrifugadas, mas tanto o sangue total como as células sanguíneas devem ser tratados com Trizol. Após o congelamento rápido em nitrogênio líquido, armazenar a -80°C e transportar em gelo seco.
- O que devo ter em atenção durante a recolha de amostras de tecido fresco?
- Após a isolação de amostras de tecido fresco, enzimas de RNA endógenas nas amostras degradarão rapidamente o RNA em um curto período de tempo, e a apoptose também afetará a expressão dos níveis de transcritos nas amostras de tecido fresco. Portanto, recomenda-se que as amostras de tecido fresco sejam obtidas de forma criogénica e rápida, imediatamente e adequadamente congeladas em nitrogênio líquido, armazenadas a -80°C e transportadas em gelo seco. Minimizar o tempo de exposição das amostras de tecido ao ar à temperatura ambiente para garantir a integridade do RNA.
- Podem as amostras de tecido ser armazenadas diretamente em gelo seco para sequenciação do transcriptoma e esse armazenamento afetará os resultados da sequenciação?
- Após a recolha das amostras de tecido, estas devem ser armazenadas em solução de proteção de RNA e, em seguida, transferidas para gelo seco para minimizar a degradação do RNA que pode afetar os resultados do sequenciamento subsequente. (Observação: As amostras de tecido devem ser cortadas e trituradas para garantir que a solução de proteção de RNA infiltre completamente as amostras).
- O que devo ter em atenção ao preparar amostras clínicas, como amostras de tumor?
- As amostras de tumor são altamente ativas e o RNA será quase completamente degradado em pouco tempo em condições de temperatura ambiente. Portanto, recomenda-se que as amostras de tumor sejam obtidas a baixa temperatura e rapidamente, congeladas de forma imediata e adequada em azoto líquido, armazenadas a -80°C e transportadas em gelo seco. Minimizar o tempo de exposição das amostras de tecido ao ar a temperatura ambiente para garantir a integridade do RNA (para requisitos específicos de entrega, consulte as nossas diretrizes de entrega de transcriptoma).
- Posso usar tripsina para digerir células com parede para RNA-seq e coletar amostras?
- 1. Remova as células cultivadas aderentes do incubador, observe as células ao microscópio para determinar o bom estado de crescimento e descarte o meio.
2. Adicione 1×PBS preparado com o mesmo volume de água isenta de enzimas que o meio, lave as células durante 1 minuto, depois descarte o PBS e repita uma vez.
3. Adicione a quantidade apropriada de solução de lise, soprando repetidamente até que esteja totalmente lisada (Trizol, por exemplo, prato de 10-15 cm, adicionando a cada vez 1-2 mL, soprando e misturando; o critério para uma lise adequada é que o líquido não seja viscoso ao soprar, apresentando boa fluidez. Se o líquido for demasiado viscoso, significa que a lise não é suficiente e deve-se adicionar mais solução de lise.)
4. Após a transferência para um tubo de liofilização com boca roscada resistente a -192°C, armazenamento a longo prazo em congelador a -80°C, transporte em gelo seco.
(Nota: Tente não usar digestão com tripsina, a tripsina é mais uma experiência de operação de teste, uma má operação fará com que as células se rompam.)
- 1. Remova as células cultivadas aderentes do incubador, observe as células ao microscópio para determinar o bom estado de crescimento e descarte o meio.
- Especime para mRNA, a amostra foi precipitada em isopropanol, pode ser enviada diretamente ou devo purificar o RNA e depois enviar a amostra?
- Após adicionar cloroformo e centrifugar, a amostra é dividida em uma camada aquosa e uma camada orgânica. Após coletar a camada aquosa, o RNA pode ser concentrado por precipitação com isopropanol. Uma vez que o cliente já realizou a etapa de precipitação com isopropanol, é melhor extrair o RNA e depois enviar a amostra para economizar tempo de extração.
- Posso fazer transcriptoma geral com amostras de secções de parafina?
- Não. As secções de parafina não podem ser utilizadas para o transcriptoma geral. Porque a amostra de secção de parafina é muito fácil de degradar, o fragmento de mRNA na amostra pode estar incompleto.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
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