Visão Geral do Sequenciamento Metatranscriptómico: Princípios, Fluxo de Trabalho e Aplicações

O que é sequenciação metatranscriptómica?

Sequenciação metatranscriptómica fornece acesso direto a informações do transcriptoma microbiano cultivável e não cultivável através de sequenciação em larga escala e de alto rendimento de transcritos de todas as comunidades microbianas em amostras ambientais específicas. A sequenciação metatranscriptómica oferece uma oportunidade para sequenciar aleatoriamente mRNAs como uma unidade para compreender a regulação de processos complexos em comunidades microbianas. O estudo do metatranscriptoma através de técnicas de Sequenciação de Nova Geração permite-nos obter perfis de expressão génica de populações microscópicas inteiras, proporcionando novas perspetivas sobre sistemas biológicos pouco conhecidos e superando limitações técnicas relacionadas com a isolação de bactérias individuais.

Desafios do sequenciamento metatranscriptómico

Embora as técnicas metatranscriptómicas atuais sejam promissoras, ainda existem vários obstáculos que limitam a sua aplicação em grande escala. Primeiro, grande parte do RNA colhido provém de RNA ribossómico (rRNA), e a sua abundância dominante pode reduzir drasticamente a cobertura de mRNA, que é o principal foco dos estudos transcriptómicos. Para contornar isso, foram feitos alguns esforços para remover eficazmente o rRNA. Em segundo lugar, o mRNA é notoriamente instável, comprometendo a integridade da amostra antes da sequenciação. Em terceiro lugar, diferenciar entre RNA hospedeiro e microbiano pode ser desafiador, embora existam kits comerciais de enriquecimento disponíveis. Isso também pode ser feito. in silico se um genoma de referência estiver disponível para o hospedeiro, como no trabalho de Perez-Losada et al.. que considerou o impacto das interações hospedeiro-patógeno no microbioma das vias aéreas humanas. Por fim, as bases de dados de referência do transcriptoma são limitadas pela sua cobertura.

Fluxo de trabalho de sequenciação metatranscriptómica

O fluxo de trabalho geral para sequenciação metatranscriptómica é mostrado na Figura 1. Para simplificar, o primeiro passo é extrair RNA total da amostra e, em seguida, detetá-lo. O RNA qualificado é submetido a triagem de fragmentos, construção de base de dados e testes de qualidade correspondentes. A biblioteca qualificada será sequenciada (principalmente utilizando a plataforma de sequenciação Illumina). Os dados brutos obtidos pela sequenciação serão utilizados para análise bioinformática.

Figura 1. Um fluxo de trabalho típico de sequenciação metatranscriptómica (Peimbert M, et al.. 2016)

O processo de preparação da biblioteca de metatranscriptómica é mostrado na figura 2. As duas principais estratégias para o enriquecimento de mRNA estão ilustradas, seja através da separação de rRNA por meio de hibridização com sondas de rRNA 16S e 23S, ou pela depleção de rRNAs através de uma 5-exonuclease. Em seguida, a primeira cadeia de cDNA é sintetizada por meio de transcriptase reversa utilizando hexâmeros aleatórios. E a segunda cadeia de cDNA é sintetizada por uma DNA polimerase. Finalmente, adaptadores de sequenciação são anexados às cadeias de cDNA, e isso pode ser feito seja por PCR ou por ligadura.

Figura 2. O processo de preparação da biblioteca de sequenciamento metatranscriptómico (Peimbert M, et al.. 2016)

O processo geral da bioinformática de sequenciação metatranscriptómica é mostrado na Figura 3. Os principais passos são: filtragem das leituras, seleção da biblioteca entre o alinhamento da sequência de referência e a execução. de novo montagem, anotação, análise estatística e upload dos conjuntos de dados originais, montados e anotados.

Figura 3. O processo bioinformático geral de sequenciação metatranscriptómica (Peimbert M, et al.. 2016)

As aplicações da metatranscriptómica

• Saúde humana

As bactérias simbióticas (flora normal) desempenham um papel fundamental na proteção contra patógenos, mas sob certas condições podem ultrapassar as respostas protetoras do hospedeiro e desencadear efeitos patológicos. A análise da população microbiana pode ser utilizada como um indicador do estado de saúde de um indivíduo e como uma ferramenta poderosa para a prevenção, diagnóstico e tratamento de doenças específicas.

• Avaliação das interacções entre o microbioma e o sistema imunitário

Os efeitos da microbiota no sistema imunitário mucosal são considerados fundamentais para afetar a fisiologia do hospedeiro. Um estudo de ratos knockout (KO) do recetor tipo Toll 5 (TLR5) é um exemplo interessante da utilização da metatranscriptómica para complementar caracterização metagenómica e Perfilagem do gene 16S rRNA desta interação imune microbiana. A análise de metatranscriptómica mostrou que a expressão dos genes relacionados com o motor flagelar estava aumentada em camundongos TLR5KO em comparação com camundongos do tipo selvagem. Neste modelo, o reconhecimento da flagelina pelo TLR 5 provoca a produção de anticorpos anti-flagelina, resultando na down-regulação de vários genes do motor flagelar bacteriano, inibindo assim a microflora. A deleção do TLR 5 resulta numa produção reduzida de anticorpos anti-flagelina, levando à up-regulação dos genes do motor flagelar bacteriano, aumentando assim a capacidade das bactérias no ambiente gastrointestinal de perturbar a barreira mucosa.

• Estudo de pequenos RNAs não codificantes do microbioma

O transcriptoma bacteriano inclui pequenos RNAs não codificantes (sRNAs), que têm tipicamente entre 50 e 500 bp de tamanho e estão envolvidos na regulação genética. Eles regulam a tradução ou a estabilidade do transcrito ao interagir com a região 5'-não traduzida (UTR) da sequência de mRNA alvo. São importantes pela sua capacidade de regular processos significativos em bactérias, como o metabolismo do ferro, a virulência e a detecção de quorum, além de se adaptarem rapidamente a ambientes em mudança. O surgimento de métodos de sequenciação de nova geração acelerou a sua identificação em várias bactérias, como Salmonela e Bacillus subtilisOs métodos de sequenciação de próxima geração também oferecem uma oportunidade para estudar sRNAs bacterianos a nível comunitário. Por exemplo, a análise de metatranscriptómica de bactérias de diferentes profundidades do oceano sugere que os sRNAs têm um papel potencial na adaptação a nichos. A metatranscriptómica da microflora intestinal da atividade humana identificou um número de sRNAs, embora o seu papel na microflora intestinal ainda não tenha sido elucidado.

• Descoberta de fármacos

Centenas de fármacos utilizados hoje derivam de compostos bacterianos. O estudo de metagenomas ou metatranscriptomas em comunidades microbianas oferece novas oportunidades para explorar fontes inovadoras para a descoberta de medicamentos que estão inacessíveis hoje devido a limitações técnicas na isolação destes microrganismos não cultiváveis.

• Agricultura

As comunidades microbianas que vivem em torno das plantas desempenham um papel vital nos nutrientes necessários para o crescimento das plantas. Além disso, a presença de micro-comunidades específicas torna as culturas saudáveis e produtivas. A metagenómica e a metatranscriptómica oferecem uma oportunidade para explorar como as populações microbianas do solo produzem culturas mais saudáveis e com maior rendimento.

• Ecologia

Os microrganismos são capazes de remover uma ampla variedade de substâncias nocivas naturais e sintéticas e convertê-las em outros compostos inofensivos para os seres humanos e o meio ambiente. Não sei como estas comunidades microbianas degradam produtos químicos nocivos, mas isso proporciona novas soluções para reparar e monitorizar a poluição ambiental ou melhorar os métodos de purificação da água potável.

• Indústria alimentar

Os métodos de metagenómica e metatranscriptómica podem ser utilizados para melhorar a qualidade, função e segurança dos alimentos, e fornecer informações relacionadas às atividades metabólicas das comunidades microbianas.

Na CD Genomics, fornecemos-lhe sequenciação de alta qualidade e integrada. bioinformática análise para o seu metatranscriptómica projeto. Se tiver requisitos adicionais ou perguntas, não hesite em contactar-nos.

Referências:

1. Peimbert M, Alcaraz L D. Um Guia do Mochileiro para Sequenciação Metatranscriptómica [M]// Diretrizes de Campo para Projetos Experimentais Genéticos em Sequenciação de Alto Rendimento. Springer International Publishing, 2016.
2. Vanessa A P, Huang W, Victoria S U, et al.Metagenómica, sequenciação metatranscriptómica e abordagens de metabolómica para análise do microbioma: [J]. Bioinformática Evolutiva Online, 2016, 12(Supl 1):5-16.
3. Dick G. Sequenciação metatranscriptómica [M]// Abordagens Genómicas em Ciências da Terra e Ambientais Maurice C F, Haiser H J, Turnbaugh P J. Xenobióticos moldam a fisiologia e a expressão génica do microbioma intestinal humano ativo[J]. Célula, 2013, 152(1-2):39-50.
4. Warnecke F, Hess M. Uma perspetiva: Metatranscriptómica como uma ferramenta para a descoberta de novos biocatalisadores[J]. Revista de Biotecnologia, 2009, 142(1):91-95.
5. Jorth P, Turner K H, Gumus P, et al.Metatranscriptómica do Microbioma Oral Humano durante a Saúde e a Doença[J]. Mbio, 2014, 5(2): e01012.
6. O’Malley M A. Metatranscriptómica[M]. Springer Nova Iorque, 2013.
7. Cao Y, Fanning S, Proos S, et al.Uma Revisão sobre as Aplicações das Tecnologias de Sequenciação de Nova Geração Aplicadas a Estudos de Microbioma Relacionados com Alimentos: [J]. Fronteiras em Microbiologia, 2017, 8:1829.
8. Bashiardes S, Zilberman-Schapira G, Elinav E. Uso de Metatranscriptómica na Investigação do Microbioma[J]. Bioinformática e Perspectivas em Biologia, 2016, 10(10):19-25.