A Aplicação da Sequenciação por Imunoprecipitação de RNA (RIP-seq) na Investigação do Carcinoma Hepatocelular (CHC) e do Cancro Ovariano

RIP-seq (imunoprecipitação de RNA) é uma tecnologia para estudar a ligação de RNA e proteína nas células. O RIP utiliza o anticorpo da proteína alvo para precipitar o complexo correspondente de RNA-proteína (RBP), isolar e purificar o RNA capturado, e combinar a tecnologia de sequenciamento de alto rendimento para sequenciar e analisar o RNA alvo. O RIP pode ser considerado uma aplicação semelhante da tecnologia de imunoprecipitação de cromatina ChIP, onde o alvo da ligação com a proteína é o RNA, e esta tecnologia tem sido amplamente utilizada. O RIP seq refere-se ao sequenciamento de alto rendimento de fragmentos de RNA enriquecidos e é uma ferramenta poderosa para entender o processo dinâmico da rede regulatória pós-transcricional, além de ajudar a descobrir alvos regulatórios de RNA.

Nos últimos anos, o RIP-seq tem feito contribuições extraordinárias na pesquisa dos mecanismos moleculares relacionados à patologia do câncer.

Princípio experimental:

(1) Utilizar anticorpos ou marcadores de epítopo para capturar proteínas de ligação a RNA endógenas no núcleo ou citoplasma.

(2) Prevenir a ligação de RNA não específico.

(3) A proteína de ligação a RNA e seu RNA ligado foram separados por imunoprecipitação.

(4) A sequência de RNA combinada foi identificada por microarray (RIP-chip), RT-PCR quantitativa ou sequenciamento de alto rendimento (RIP-Seq).

O processo experimental do RIP-seq

Direção de aplicação:

(1) Estudar a ligação de RNA e proteína nas células.

(2) Descobrir a interação entre RBP e RNA não codificante (LncRNA, miRNA, etc.).

(3) Mapear o mapa de interação de RNA e RBP em todo o genoma.

O RIP-seq ajuda a revelar o mecanismo da modificação pós-traducional de proteínas

A infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) é um fator de risco importante para o carcinoma hepatocelular (HCC). O leitor de RNA N6-metiladenosina (m6A), domínio YTH (homologia YT521-B) 2 (YTHDF2), desempenha um papel crítico na progressão do HCC. Estudos recentes descobriram que o YTHDF2 pode ser modificado por O-GlcNAc e confirmaram que a Ser263 é o local chave para a modificação O-GlcNAc do YTHDF2 através da imunoprecipitação combinada com espectrometria de massa (IP-MS). Além disso, os pesquisadores selecionaram e identificaram MCM2 e MCM5 como moléculas modificadas por m6A reguladas por m6A-seq, RIP-seq, RNA-seq e outras tecnologias. A O-GlcNAcilação mediada por OGT do YTHDF2 na Ser263 promoveu a estabilização do mRNA de MCM2 e MCM5 de maneira dependente de m6A no HCC. Este estudo fornece novas ideias para encontrar novos marcadores prognósticos e alvos moleculares do carcinoma hepatocelular associado ao HBV.

Identificação de alvos do YTHDF2 por RNA-seq, m6A-seq e RIP-seq

Identificação de eventos de splicing por RNA-seq e RIP-seq na pesquisa sobre câncer de ovário

O splicing alternativo tem sido associado a várias doenças, incluindo cânceres humanos. A expressão aberrante de fatores de splicing foi encontrada para promover a tumorigenese e o desenvolvimento de tumores malignos humanos. O câncer de ovário é a malignidade ginecológica mais letal e a expressão anormal de fatores de splicing está relacionada ao desenvolvimento do câncer de ovário. Estudos recentes descobriram que as proteínas reguladas positivamente em HGSOCs estão significativamente enriquecidas em proteínas da via de splicing. O fator de splicing USP39 é frequentemente superexpresso em HGSOC, e o aumento do nível de USP39 está associado a um prognóstico ruim. O USP39 promove a proliferação/invasão in vitro e o crescimento tumoral in vivo e foi ativado transcricionalmente pela proteína oncogênica c-MYC em células de câncer de ovário simultaneamente. Os eventos de splicing variáveis regulados pelo USP39 foram identificados por sequenciamento de RNA (RNA-seq) e sequenciamento de imunoprecipitação de RNA (RIP-seq). Em particular, o USP39 promove o splicing eficaz de HMGA2 (grupo de alta mobilidade AT-hook 2), aumentando assim a malignidade das células do câncer de ovário. Este estudo indica que o USP39 pode representar um novo biomarcador prognóstico e um potencial alvo do HGSOC.

Identificação de eventos de splicing regulados por USP39 por RNA-seq e RIP-seq

A tecnologia RIP é uma ferramenta poderosa para estudar o processo dinâmico da rede regulatória pós-transcricional. Os resultados detectados pelo RIP-seq têm ampla cobertura e alta capacidade de rendimento. Sua aplicação pode tornar o nível de pesquisa abrangente e o mecanismo mais completo, ajudando-nos a entender as mudanças de RNA em um nível geral do câncer e outras doenças através de alto rendimento.

Referências:

1. Xie, Fei et al. "CircPTPRA bloqueia o reconhecimento de RNA N6-metiladenosina através da interação com IGF2BP1 para suprimir a progressão do câncer de bexiga." Câncer molecular vol. 20,1 68. 14 Abr. 2021.
2. Wang, Shourong et al. "O fator de splicing USP39 promove a malignidade do câncer de ovário através da manutenção do splicing eficiente do oncogênico HMGA2." Morte celular & doença vol. 12,4 294. 17 Mar. 2021