Perguntas e Respostas sobre Perfilagem de Ribossomas

Sequenciação de ribossomas pode obter informações precisas e quantificação exata de todas as moléculas traduzíveis (incluindo mRNA e outras moléculas de RNA potencialmente traduzíveis, como lncRNA, circRNA, etc.) numa amostra, e é uma ponte entre o transcriptoma e o proteoma.

A RNA-Seq pode refletir o tipo e a quantidade de mRNA nas células, e também pode detectar variações de sequência e splicing variável de mRNA. No entanto, não reflete se o mRNA é traduzido na proteína correspondente e o nível de tradução. A análise do translatoma pode estudar o nível, a região e a taxa de tradução de genes nas células, etc.. Combinando transcriptoma, sequenciação de pequenos RNAse o proteoma para análise de correlação, podemos estudar a regulação pós-transcricional e o mecanismo de regulação da tradução de forma mais precisa.

As taxas de captura de tradução podem revelar quais genes estão a ser expressos, em que quantidades e quando são necessários. A profilagem de ribossomas permite a monitorização em todo o genoma da síntese proteica em curso e complementa outras abordagens globais (por exemplo, sequenciação de RNA). De facto, a sequenciação de ribossomas tem sido utilizada para estudar o mecanismo de ação de antibióticos fenotípicos em bactérias, os mecanismos de regulação em plantas e animais sob stress adverso, os mecanismos moleculares do envelhecimento do desenvolvimento em indivíduos e os mecanismos de desenvolvimento de tumores, entre outros. Se tiver um projeto que requer consulta, pode contato os nossos especialistas técnicos.

O método de adição de cauda poli-A sacrifica o rendimento para garantir a precisão da extremidade 5' da biblioteca, o que é crítico para uma boa periodicidade de tripletos. O IFR baseado neste método é de aproximadamente 50-60%.
O método de ligação de adaptadores obtém um alto rendimento; no entanto, a precisão da extremidade 5' da biblioteca é baixa. Existem cerca de 30% das leituras cujos primeiros nucleótidos não podem ser alinhados ao genoma, provavelmente devido à adição não templada durante a transcrição reversa. Assim, é necessária a remoção do primeiro nucleótido de desajuste da extremidade 5' para obter um P-site preciso.

O inibidor da síntese de proteínas cicloxeximida (CHX) é amplamente utilizado em experimentos de Ribo-seq. Estudos recentes descobriram que a CHX pode causar uma regulação positiva da transcrição de genes envolvidos na produção de ribossomas, resultando numa diminuição significativa da eficiência de tradução. Além do efeito na transcrição, a concentração de CHX utilizada também afeta a distribuição das "impressões" ribossomais no mRNA, com concentrações baixas de CHX a causarem um viés artificial que pode ser evitado ao aumentar as concentrações de CHX.

Usar ribonuclease (RNase) para digerir partes de mRNA localizadas fora do ribossoma é um passo importante na sequenciação de ribossomas. Portanto, a seleção da RNase e a concentração utilizada são cruciais.
Atualmente, o mais utilizado é a RNase I. A maior vantagem da RNase I em relação a outras é que não tem preferência por bases para a clivagem. No entanto, para algumas espécies (por exemplo, humana), a eficiência na obtenção de ribossomas 80S com RNase I é baixa, e é difícil obter os ribossomas 80S desejados se a quantidade de RNase I não for bem controlada, como demonstrado pelo fato de que, se a concentração de RNase I for demasiado alta, a integridade dos ribossomas será severamente danificada, fazendo com que a biblioteca final contenha uma grande quantidade de RNA ribossómico (rRNA). Se a concentração de RNase I for demasiado baixa, embora alguma integridade ribossómica possa ser mantida, isso fará com que os fragmentos de mRNA protegidos pelos ribossomas sejam clivados de forma incompleta. Portanto, é necessário um pré-teste para determinar a ribonuclease a ser utilizada e a concentração de trabalho da ribonuclease.