A Introdução e o Fluxo de Trabalho do Sequenciamento de Bibliotecas Pré-fabricadas

O que é Sequenciação de Biblioteca Pré-fabricada?

Para sequenciação de próxima geração, sequenciações totalmente automatizadas a um custo por base mais baixo e tempos de ensaio mais rápidos estão disponíveis com os instrumentos de alto rendimento e de bancada recentemente introduzidos. Como resultado, um importante estrangulamento foi detectado no complexo e demorado processo de preparação de bibliotecas, que começa com ácidos nucleicos isolados e termina com DNA amplificado e codificado com adaptadores de sequenciação. Os protocolos de preparação de bibliotecas são geralmente processos em múltiplas etapas que requerem reagentes caros e muito tempo de manuseio. Para garantir robustez e reprodutibilidade, será necessária uma forte ênfase na padronização.

Sequenciação de bibliotecas pré-fabricadas é comum sequenciação de alto rendimento abordagem utilizada para analisar informações genómicas dentro de amostras de ADN. O foco principal de sequenciação pré-biblioteca encontra-se na preparação de bibliotecas de DNA, que contêm fragmentos de DNA preparados prontos para sequenciação. Estes fragmentos de DNA geralmente provêm de várias amostras utilizadas em investigação biológica. Sequenciação pré-biblioteca pode ser realizado usando sequenciação de segunda geração plataformas, assim como plataformas de sequenciação de terceira geração como Sequenciação SMRT da PacBio e Sequenciação por Nanoporos.

Qual é o Fluxo de Trabalho da Sequenciação de Bibliotecas Pré-Fabricadas?

Preparação de Bibliotecas de Sequenciação:

Figura 1. Fluxo de trabalho básico para a preparação de bibliotecas de NGS. (Head et al., 2014)

• Bibliotecas de sequenciação de DNA e RNA

Começando com DNA genómico ou RNA, pode ser criada uma biblioteca de sequenciação. O fluxo de trabalho para criar uma Sequenciação de DNA a biblioteca é composta por três etapas básicas:
- Fragmentação e dimensionamento de ácidos nucleicos (DNA ou RNA) para adquirir fragmentos de um comprimento predeterminado,
- Conexão de adaptadores às extremidades do fragmento, e
- Quantificação de biblioteca.

Há um passo adicional em qualquer Sequenciação de RNA biblioteca: Conversão de RNA em cDNA. O procedimento de fragmentação pode ser realizado antes ou depois da síntese de cDNA.

• Fragmentação

Métodos físicos, métodos enzimáticos e métodos químicos podem ser utilizados para fragmentar ácidos nucleicos (DNA, RNA ou cDNA). As técnicas mais frequentemente utilizadas são as físicas e enzimáticas. Especificamente, fragmentos longos podem ser obtidos para bibliotecas de pares de mate (6.000 a 20.000 pb).

• Dimensionamento de fragmentos

O tamanho dos fragmentos é extremamente importante. O tamanho ideal dos fragmentos da biblioteca é determinado pela plataforma a ser utilizada e pelo âmbito da análise. Em plataformas Illumina, por exemplo, podem ser utilizados fragmentos de até 1.500 pb no caso de sequenciação do exomano entanto, sugere-se um tamanho máximo de inserção de 200-250 pb. Isto deve-se ao tamanho médio de um exão humano, que é de 200 pares de bases.

• Anexação dos adaptadores

Os chamados adaptadores devem ser fixados a ambas as extremidades de cada fragmento uma vez que a fragmentação do DNA ou RNA esteja completa. Por definição, uma biblioteca de sequenciamento é uma coleção de fragmentos de DNA com adaptadores conectados. Os adaptadores são feitos para funcionar com uma plataforma de sequenciamento específica, como a superfície da célula de fluxo ou esferas. Após a fixação dos adaptadores, ocorre uma fase de dimensionamento, durante a qual todos os fragmentos de tamanho indesejável e todos os dímeros de adaptadores são removidos. Os dímeros de adaptadores formam-se quando os adaptadores se auto-ligam sem uma sequência de inserção da biblioteca, e são especialmente comuns quando a quantidade inicial de DNA é baixa. É crítico remover os dímeros de adaptadores da biblioteca porque podem reduzir significativamente o rendimento do sequenciamento ao consumir espaço valioso na célula de fluxo. Uma limpeza com esferas magnéticas pode efetivamente eliminar os dímeros.

• Quantificação de biblioteca

A quantificação da biblioteca é um passo crítico que deve ser realizado utilizando o método mais preciso e prático possível. Métodos baseados em PCR (PCR digital ou PCR quantitativa) são comumente utilizados para quantificar bibliotecas de sequenciação.

• A qualidade final da biblioteca de sequenciação

Ao criar uma biblioteca de sequenciação, é fundamental procurar o nível mais alto de complexidade possível. Em outras palavras, é crucial que a biblioteca final capture o máximo de singularidade do material original. Limitar o número de duplicações segmentares é o primeiro passo para alcançar este resultado. Quanto mais curtos forem os fragmentos, maior a probabilidade de serem menos específicos e se alinharem em múltiplos loci na sequência de referência. Como resultado, a percentagem de leituras duplicadas nos dados de sequenciação pode ser utilizada para determinar a complexidade da biblioteca.

Sequenciação:

Após passar por procedimentos de controlo de qualidade e amplificação, a biblioteca de ADN é processada para sequenciação de alto rendimento num sequenciador. A sequenciação de bibliotecas pré-fabricadas geralmente utiliza plataformas como a Illumina, que têm a capacidade de produzir uma quantidade substancial de leituras de sequências curtas.

Análise de Dados:

Após a conclusão da sequenciação da biblioteca, os dados de sequência resultantes são transferidos para um sistema computacional para bioinformática análise. O processo analítico abrange atividades sequenciais, incluindo controlo de qualidade das sequências, alinhamento das sequências e identificação de variantes. Durante a fase de controlo de qualidade, os dados de sequência originais passam por filtragem para excluir sequências de baixa qualidade. Subsequentemente, através do alinhamento com um genoma de referência ou montagem do genoma, podem ser discernidos os atributos de origem e posicionais das sequências de DNA. Por fim, mecanismos como a deteção de variantes permitem a identificação de modificações genéticas na amostra, como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) ou variações estruturais (SVs), revelando assim a informação genética característica da amostra de DNA.

Conclusão

Sequenciação de biblioteca pré-fabricada desempenha um papel vital em vários estudos genómicos. Serve como uma pedra angular em sequenciação do genoma, facilitando a aquisição rápida de dados de sequenciamento de genoma completo de alta qualidade e promovendo a investigação genómica em humanos, plantas, animais e outros organismos. Em sequenciação do transcriptoma, sequenciação de biblioteca pré-fabricada decodifica de forma abrangente perfis de expressão génica, ajudando os investigadores a compreender os mecanismos regulatórios dos genes sob diferentes condições.

Além disso, sequenciação de biblioteca pré-fabricada tem aplicações significativas em epigenómica pesquisa. É utilizado para analisar marcadores epigenéticos como a metilação do DNA e as modificações das histonas, revelando a intrincada rede de regulação da expressão gênica. No domínio do genotipagem e deteção de variantes, sequenciação de biblioteca pré-fabricada destaca-se por detectar com precisão polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e variações estruturais (SVs), oferecendo um suporte de dados crucial para a medicina personalizada e a investigação de doenças.

Em conclusão, sequenciação de biblioteca pré-fabricada destaca-se como um método robusto e eficiente em termos de tempo para analisar genomas em vários espécimes biológicos. O seu fluxo de trabalho simplificado, que começa com a construção da biblioteca de DNA e culmina em análises bioinformáticas, permite uma caracterização genómica rápida e precisa. Ao contornar procedimentos extensivos de preparação de amostras, sequenciação de biblioteca pré-fabricada diminui as discrepâncias experimentais e reduz o consumo de recursos.

A CD Genomics oferece sequenciação de biblioteca pré-fabricada serviços, utilizando plataformas de sequenciação com capacidades e comprimentos de leitura variados para atender a diversas necessidades de investigação. Além disso, oferecemos uma vasta gama de serviços de sequenciação, incluindo Sequenciação Genómica, Sequenciação do Transcriptoma, Sequenciação Epigenómicae GenotipagemA nossa equipa de profissionais qualificados está dedicada a fornecer um apoio e assistência excecionais, garantindo o sucesso das suas iniciativas de investigação.

Referências:

1. Hess JF, Kohl TA, Kotrová M, et al. Preparação de bibliotecas para sequenciação de nova geração: uma revisão das estratégias de automação. Avanços em biotecnologia. 2020 Jul 1;41.
2. Head SR, Komori HK, LaMere SA, et al. Construção de bibliotecas para sequenciação de nova geração: visões gerais e desafios. Biotécnicas. Fevereiro de 2014;56(2).
3. Robin JD, Ludlow AT, LaRanger R, et al. Comparação de métodos de quantificação de DNA para sequenciação de nova geração. Relatórios científicos. 2016 Abr 6;6(1).