O que é a Análise de Splicing Alternativo?

O que é a Splicing Alternativa?

Splicing alternativo, um mecanismo fundamental na regulação da expressão genética eucariótica, contribui significativamente para a expansão da diversidade funcional dentro dos genes. Este processo envolve o splicing seletivo de exões e íntrons interativos nas sequências genéticas biológicas, permitindo que um único gene gere múltiplos transcritos. Cada transcrito possui locais de splicing distintos na sequência codificadora, levando à produção de proteínas com funções diversas.

Aproximadamente 95% dos genes sofrem splicing alternativo, resultando em células a expressar cerca de quatro isoformas por gene. O splicing alternativo manifesta-se em cinco tipos principais:

• Exon Saltar (ES)
• Local de Splice Alternativo 5' (A5SS)
• Local de Splice Alternativo 3' (A3SS)
• Exão Mutuamente Exclusiva
• Retenção de Intron (RI)

Análise de Splicing Alternativo em Sequenciação de RNA

Nos últimos anos, sequenciação de RNA em massa paralela (RNA-Seq) surgiu como uma ferramenta poderosa para a realização de análises transcriptómicas abrangentes. A diminuição dos custos de sequenciação profunda facilitou investigações em larga escala sobre a expressão génica e o splicing alternativo, levando a um aumento na identificação de doenças associadas a essas variações de splicing. O conhecimento adquirido a partir destes estudos detém um grande potencial para o desenvolvimento de intervenções preventivas e terapêuticas.

O mapeamento e a quantificação precisos de eventos de splicing alternativo são cruciais para análises subsequentes, particularmente na correlação de doenças com padrões de splicing específicos. Apesar da adoção generalizada de RNA-Seq de alto rendimento, discernir com precisão a expressão de homodímeros e obter resultados quantitativos para o splicing alternativo a partir dos dados resultantes continua a ser um desafio.

Em experiências de RNA-Seq, o mRNA é extraído de tecidos, fragmentado e transcrito reversamente em cDNAs. A amplificação subsequente e a sequenciação através de métodos de sequenciação de alto rendimento e leituras curtas geram dados de sequenciação a partir de amostras de tecido. Idealmente, os segmentos de leitura do transcriptoma podem ser montados utilizando software de comparação para reconstruir a região genómica transcrita. Eventos de splicing alternativo podem então ser identificados e quantificados utilizando software de análise especializado.

No entanto, limitações técnicas persistem, principalmente devido aos comprimentos de leitura limitados inerentes ao sequenciamento de próxima geração RNA-Seq (normalmente variando entre 50 pb a 150 pb). O desafio intensifica-se ao tentar distinguir isoformas de transcritos do mesmo gene, uma vez que segmentos de leitura curta raramente cruzam os locais de splicing. Esta complexidade dificulta a inferência de transcrições completas, especialmente para transcritos de baixa expressão. Além disso, identificar os locais de início e terminação da transcrição continua a ser uma tarefa difícil.

Por favor, leia o nosso artigo. PacBio Iso-Seq: Permitir a Exploração Aprofundada do Splicing Alternativo, para mais informações.

Análise de Splicing Alternativo em Sequenciação de Células Únicas

A utilização de software de análise de splicing alternativo em dados de célula única fornece informações valiosas sobre diferentes locais de splicing alternativo e genes associados dentro de cada subpopulação ou amostra. A análise diferencial subsequente ajuda a identificar locais de splicing alternativo chave entre diferentes subpopulações ou genes ligados a fenótipos específicos. Esta exploração permite aos investigadores desvendar as associações intrincadas entre os locais de eventos de splicing alternativo e vários tipos de células ou fenótipos.

Ao avaliar a splicing alternativa, é crucial considerar a distribuição uniforme das leituras de cDNA por todo o gene. Uma distribuição uniforme significa alta aleatoriedade na ligação das sequências capturadas, facilitando a cobertura completa do mRNA—um pré-requisito essencial para uma análise precisa da splicing alternativa.

Embora os transcriptomas de células únicas de extremidade única possam capturar certas informações sobre locais de splicing alternativo, o enriquecimento na extremidade única restringe a quantidade de informação disponível. Esta limitação dificulta a explicação abrangente dos isoformas de splicing alternativo e das proteínas codificadas subsequentes do gene.

Ferramentas para Quantificação Precisa de Splicing Alternativo

Ao longo da última década, foram desenvolvidas ferramentas computacionais para enfrentar esses desafios. Dada a ênfase do autor em métodos baseados em eventos e o seu uso contínuo, segue-se uma breve visão geral de seis softwares notáveis para análise de splicing alternativo: rMATS, MAJIQ, LeafCutter, SUPPA2, SplAdder e Whippet.