Aprimoramento da Previsão da Função do Microbioma com Sequenciação Completa de 16s

O uso da tecnologia de sequenciação de amplicões de próxima geração suscitou debates dentro da comunidade de pesquisa do microbioma devido às suas limitações inerentes, principalmente o seu comprimento de leitura curto e a subsequente escassez de informação que fornece. A precisão taxonómica dos genes marcadores é um fator crucial que influencia diretamente a fiabilidade e credibilidade da previsão da função do microbioma. Portanto, surge uma questão chave: pode a previsão de função baseada nos resultados da sequenciação de amplicões de próxima geração ser considerada credível, e existe uma alternativa superior para promover uma pesquisa mais eficiente e precisa no domínio da previsão de função?

Um estudo recente aprofundou-se na precisão da previsão de funções e lançou luz sobre algumas preocupações críticas relacionadas com a solidez biológica da previsão de funções do microbioma. Este estudo analisou o papel da composição taxonómica, particularmente quando derivada de sequenciação de leituras curtas, e examinou fatores como a resolução taxonómica de genes marcadores, a variabilidade intragenómica desses genes e a natureza composicional dos dados do microbioma. Afirmou de forma convincente que Sequenciação completa de 16s está prestes a substituir o sequenciamento de leituras curtas como o método principal para prever a função do microbioma. Esta transição deverá inaugurar uma nova era em que o sequenciamento completo de 16s ocupará o centro das atenções na previsão da função do microbioma, oferecendo uma precisão e credibilidade aprimoradas neste domínio de pesquisa crítico.

Predição do potencial funcional a partir de perfis taxonómicos do microbioma gerados por sequenciação de amplicões de leitura curta. (Heidrich et al., 2022)

Resolução Taxonómica na Sequenciação Completa do 16s

No domínio da investigação em microbiologia, sequenciação de amplicões de leitura curta O uso da plataforma Illumina é a tecnologia predominante escolhida. O modo de sequenciação PE300, que gera sequências de 2x300 pares de bases, é amplamente adotado. Neste domínio, a sequenciação de amplicões longos de leituras curtas é predominantemente utilizada para examinar os segmentos taxonomicamente informativos do RNA ribossómico bacteriano 16s e dos loci do espaçador interno transcrito (ITS) de fungos. No entanto, a sequenciação de regiões parciais destes genes na plataforma Illumina frequentemente apresenta limitações na discriminação a nível de espécies e tem dificuldades em diferenciar estirpes estreitamente relacionadas.

Avanços recentes demonstraram o potencial de sequenciação completa de 16s, alcançado através de tecnologias de sequenciação de leitura longa como PacBio, para melhorar significativamente a resolução taxonómica. O sequenciamento completo do 16S cobre de forma abrangente todas as nove regiões variáveis do gene 16S rRNA, proporcionando assim uma riqueza de informações que supera a do sequenciamento de uma única região. Promete uma identificação taxonómica precisa ao nível das espécies e pode discernir eficazmente polimorfismos de sequência enquanto identifica posições taxonómicas.

Além disso, sequenciamento completo de 16S não só identifica com precisão polimorfismos de sequência, mas também permite a localização de variações a nível de estirpe. Esta sensibilidade aumentada potencia a descoberta de novas espécies microbianas e proporciona uma representação mais fiel das estruturas das comunidades microbianas dentro das amostras.

Embora o custo do sequenciamento completo de 16S continue relativamente elevado, espera-se que, a longo prazo, esta tecnologia, seja alcançada através de sequenciação de amplicões de leitura longa ou a reconstrução em bioinformática a partir de sequenciação de amplicões de leituras curtas identificadas de forma única, irá gradualmente substituir os métodos de sequenciação de leituras curtas. Esta mudança promete elevar a resolução taxonómica e, consequentemente, promover previsões mais precisas das funções microbianas.

Variabilidade Intragenómica de Genes Marcadores

Outro desafio na análise da estrutura do microbioma utilizando dados de sequenciação de amplicons reside nas diferentes quantidades de cópias de genes marcadores dentro dos genomas microbianos. Esta variabilidade é ocasionalmente mal interpretada como diversidade alélica, podendo introduzir confusão na análise da composição do microbioma. Simultaneamente, a variabilidade intragenómica dentro dos genes marcadores dificulta a avaliação precisa da importância relativa de funções potenciais, podendo levar a uma superestimação da diversidade dentro dos perfis funcionais potenciais.

As limitações da tecnologia de Sequenciação de Nova Geração (NGS) tornam-se evidentes na sua incapacidade de identificar com precisão a variabilidade genética intragenómica. Isto deve-se principalmente ao comprimento curto das leituras da tecnologia e à cobertura de sequenciação restrita. Em forte contraste, Sequenciação completa do 16Scaracterizado pela sua cobertura e precisão superiores, destaca-se na identificação precisa de polimorfismos de sequência e na localização de variações a nível de estirpe.

A Nature Composicional dos Dados do Microbioma

Um aspecto crítico a considerar é que o número de leituras de sequência geradas pela Sequenciação de Nova Geração (NGS) a partir de uma amostra não se correlaciona diretamente com o número de células bacterianas dentro dessa amostra, tornando problemático traduzir as leituras em abundância bacteriana. A NGS revela apenas o tamanho relativo de um segmento específico da comunidade microbiana representado por cada unidade taxonómica. Esta característica compõe o conjunto de dados do microbioma NGS para fornecer insights sobre a abundância relativa das leituras de sequência, expressa como proporções ou frequências de táxons em uma comunidade microbiana. No entanto, não fornece informações sobre a abundância absoluta de táxons, principalmente porque o tamanho total (biomassa microbiana) da comunidade permanece desconhecido.

Consequentemente, mesmo que o perfil funcional previsto de uma comunidade esteja alinhado com a sua função real, estimar a magnitude do potencial funcional torna-se um desafio formidável devido à falta de consideração pelo tamanho total da população da comunidade. Existem vários métodos de quantificação microbiana para abordar esta limitação, mas estes podem introduzir uma heterogeneidade adicional nos dados.

Uma abordagem alternativa para mitigar o problema da análise de dados de composição microbiana é o uso de razões. Este método elimina o viés decorrente da auto-carregamento microbiano e ajuda a superar os desafios associados ao viés de amplificação por PCR, uma fonte de erro bem reconhecida que pode distorcer a composição da comunidade e as previsões funcionais.

Descobrindo a Função Genuína da Microbiota

Uma abordagem mais intrincada envolve a medição da função real da microbiota sempre que possível. No entanto, este esforço só é viável sob condições específicas: a comunidade microbiana deve ser acessível, a função alvo deve estar ativamente envolvida no momento da amostragem e deve haver um tamanho populacional e volume de amostra suficientemente grandes disponíveis para análise. Para microbiotas que não atendem a esses critérios, técnicas adicionais, como a PCR quantitativa em tempo real com fluorescência, servem como complementos valiosos para caracterizar quantitativamente o potencial genético de certos genes funcionais. É vital reconhecer que esses potenciais genéticos não se equivalem necessariamente a atividades e processos microbianos reais.

Nesta perspetiva, técnicas histológicas como a transcriptómica, proteómica e metabolómica revelam-se instrumentais na exploração do potencial genético que foi traduzido em ação. Combinar a previsão funcional com a medição de funções específicas representa uma abordagem poderosa para obter insights sobre a funcionalidade microbiana.

Referência:

1. Heidrich, Vitor, e Lukas Beule. "Os amplicons de leitura curta são adequados para a previsão do potencial funcional do microbioma? Uma perspetiva crítica." iMeta 1.3 (2022): e38.