Sequenciação de Metagenoma vs. Sequenciação de Amplicões Virais: Escolhendo Métodos de Sequenciação Eficazes para Monitorizar Mutacões Virais

O monitoramento de mutações virais ganhou uma importância primordial devido à probabilidade de mutações ocorrerem durante a transmissão viral. Isso requer um acompanhamento meticuloso dessas mutações, que é agravado pelo desafio de aumentar a sensibilidade da deteção do vírus. O cerne do desafio reside na obtenção da sequência completa do genoma viral para facilitar uma compreensão e monitoramento abrangentes das mutações. Simultaneamente, considerações sobre a relação custo-eficácia sublinham a urgência para numerosas entidades envolvidas em testes e esforços de pesquisa. Neste discurso, aprofundamo-nos numa análise abrangente de três métodos de sequenciamento robustos—Sequenciação de Metagenoma, e Sequenciação de Amplicões Virais—analisando as suas aplicações, vantagens e as complexas considerações envolvidas na monitorização de mutações virais.

Fluxo de trabalho dos métodos comumente utilizados. (Liu et al., 2021)

Propósito da Sequenciação: Detecção Rápida ou Montagem de Sequências na Monitorização Viral

A chegada da tecnologia de sequenciação de alto rendimento provocou uma mudança de paradigma na nossa capacidade de detectar e estudar novos coronavírus e outros patógenos virais. A decisão entre a deteção rápida e a montagem meticulosa de sequências torna-se um ponto crítico, dependente dos objetivos precisos da investigação ou aplicação clínica, exigindo a seleção judiciosa de metodologias e abordagens estratégicas apropriadas.

Deteção Rápida: Uma Resposta Ágil a Ameaças Emergentes

Em cenários sensíveis ao tempo, como surtos de doenças ou infecções suspeitas, a identificação rápida de patógenos virais assume uma importância primordial. O arsenal de sequenciação de alto rendimento desempenha um papel fundamental nesses contextos. Ao enfrentar desafios como a confirmação de diagnósticos em pacientes com resultados negativos em testes de qPCR, a distinção de infecções complexas ou secundárias, ou a execução de triagens extensas de um vasto conjunto de amostras, a sequenciação de alto rendimento surge como uma solução poderosa.

Vantagens:

• Oportunidade: O sequenciamento de alto rendimento acelera a identificação do material genético viral, permitindo respostas rápidas a potenciais surtos.
• Perfilamento Abrangente: Esta tecnologia permite a deteção simultânea de múltiplas espécies virais dentro de uma única amostra, facilitando uma avaliação abrangente do panorama viral.
• Sistema de Alerta Precoce: A deteção rápida serve como um mecanismo de alerta precoce, capacitando as autoridades de saúde pública a instituir intervenções e medidas de contenção em tempo útil.

Montagem de Sequências: Desvendando o Blueprint Genético

Para uma análise aprofundada e abrangente, particularmente ao confrontar patógenos desconhecidos ou desvendar a composição genética de vírus emergentes, a abordagem de montagem de sequências através de sequenciação de alto rendimento torna-se indispensável. Esta metodologia implica a aquisição de sequências completas do genoma viral, permitindo que os investigadores explorem as nuances intricadas da evolução viral, mutações e potenciais determinantes de virulência.

Vantagens:

• Elucidação Genética: A montagem de sequências oferece uma compreensão detalhada dos genomas virais, ajudando na identificação de segmentos genómicos fundamentais e potenciais alvos para medicamentos ou vacinas.
• Insights Evolutivos: O sequenciamento de alta profundidade permite que os investigadores rastreiem a trajetória evolutiva do vírus, desmascarem mutações e decifrem potenciais padrões de adaptação.
• Insights Epidemiológicos: Sequências genómicas completas facilitam estudos epidemiológicos aprofundados, permitindo que os investigadores rastreiem a propagação e evolução do vírus ao longo do tempo.

Seleção Metodológica

A escolha entre deteção rápida e montagem de sequências exige uma consideração multifacetada de vários parâmetros:

• Urgência: A urgência da situação e a necessidade imperativa de insights diagnósticos imediatos.
• Recursos: A disponibilidade de recursos laboratoriais que abrangem equipamentos, pessoal e capacidades computacionais.
• Objetivos da Pesquisa: Os objetivos específicos da pesquisa, sejam estudos epidemiológicos, desenvolvimento de vacinas ou a busca por insights sobre a evolução viral.
• Disponibilidade de Amostras: A quantidade e qualidade das amostras disponíveis para sequenciação.

Abordagens de Sequenciação: Sequenciação de Metagenomas vs. Sequenciação Direcionada 

No âmbito do sequenciamento de alto rendimento para investigar genomas virais, emergem duas metodologias distintas como ferramentas potentes: o sequenciamento de metagenomas e o sequenciamento direcionado. Cada abordagem possui forças únicas, moldando a sua adequação com base em aplicações específicas e objetivos de pesquisa.

Volume de Dados em Sequenciação: Adaptar a Quantidade ao Método e ao Objetivo

A magnitude dos dados de sequenciação tem uma relevância fundamental no sucesso da análise do genoma viral, ditada pelo propósito de sequenciação pretendido, metodologia escolhida, carga viral e outros fatores pertinentes. Encontrar um equilíbrio entre o volume de dados e os requisitos específicos assume uma importância crítica na obtenção de resultados precisos e insights significativos. De forma geral, um aumento no volume de dados aumenta a sensibilidade, eleva as taxas de positividade dos testes clínicos e fortalece a eficácia da montagem de sequências virais. Considerações vitais incluem alcançar uma cobertura do genoma viral superior a 95% e uma profundidade de base única de pelo menos 10x.

Sequenciação de Metagenomas: Adaptar o Volume de Dados às Atributos da Amostra

Para sequenciação de metagenomaso volume de dados ideal depende da natureza do material amostral em análise.

• Amostras com Cargas Virais >10⁴ cópias/ml ou Valores CT de qPCR <24,5:
• Volume de Dados Recomendado: 20Gb (PE100, 100M leituras)
• Justificação: Aumentar o volume de dados nestes casos melhora a sensibilidade e aumenta a probabilidade de obter resultados positivos em testes clínicos.

Sequenciação de Amplicon para Amostras com Carga Viral Muito Baixa

O sequenciamento de metagenoma torna-se menos eficaz quando confrontado com amostras com cargas virais muito baixas, especialmente aquelas que apresentam valores de CT superiores a 28,7. Nesses casos, uma abordagem alternativa, como o sequenciamento de amplicões por PCR multiplex, é aconselhável para obter resultados precisos e exatos.

Sequenciação de Amplicões por PCR Multiplex: Precisão na Presença de Baixa Carga Viral

Ao implementar o sequenciamento de amplicões por PCR multiplex, o volume de dados ideal varia entre 5 a 20 milhões de leituras. Esta técnica revela-se excepcionalmente valiosa ao analisar amostras com cargas virais extremamente baixas, incluindo aquelas que contêm menos de 10.² cópias/ml.

Processamento de Biblioteca de Sequenciamento para Sequenciamento de RNA Viral

No âmbito da sequenciação de RNA viral, a determinação de eliminar o RNA ribossómico (rRNA) durante a preparação da biblioteca surge como uma deliberação fundamental que impacta profundamente a qualidade e o sucesso do processo de sequenciação. Embora o rRNA constitua uma fração significativa do RNA total (frequentemente ultrapassando 80%), a sua remoção pode aumentar a eficiência e a utilidade dos dados de sequenciação gerados. No entanto, a decisão de remover o rRNA é complexa, dependendo de diversos fatores, incluindo as características da amostra, o material de entrada e os objetivos da construção da biblioteca.

A Importância da Remoção de rRNA

O RNA ribossómico assume um papel dominante no RNA celular, servindo como um ator fundamental na síntese de proteínas. No contexto do sequenciamento de RNA viral, a presença de rRNA pode diluir o conteúdo desejado de RNA viral, potencialmente dificultando a deteção e a representação fiel das sequências virais. Através da remoção seletiva de rRNA, os investigadores podem aumentar a sensibilidade da deteção viral, melhorar a eficiência da construção de bibliotecas e, em última análise, amplificar a pertinência dos dados de sequenciamento para a análise viral.

Considerações de Amostra

• Entrada Limitada de Ácido Nucleico Viral: Em cenários com escassa entrada de ácido nucleico viral, como em situações de baixa carga viral, a remoção de rRNA pode revelar-se particularmente vantajosa. A minimização da interferência do rRNA permite a captura focada de sequências virais, possivelmente resultando em resultados mais precisos e abrangentes.
• Amostras Degradadas: Amostras sujeitas a armazenamento prolongado e degradação significativa podem conter quantidades ínfimas de RNA viral intacto. Nesses casos, a remoção de rRNA pode agravar os desafios da preparação da biblioteca, diminuindo ainda mais o material de RNA disponível. Nesses cenários, os investigadores podem optar por não remover o rRNA para maximizar a probabilidade de construção bem-sucedida da biblioteca.

Equilíbrio entre a Remoção de rRNA e a Construção de Bibliotecas

Embora a remoção de rRNA ofereça benefícios em numerosos casos, alcançar um equilíbrio que se alinhe com os objetivos de construção da biblioteca e as características da amostra é crucial. Em certos cenários, otimizar o sucesso da preparação da biblioteca pode sobrepor-se à remoção de rRNA, particularmente quando confrontados com amostras marcadas por baixa abundância viral ou degradação substancial.

Resumo

• Para uma análise abrangente de todos os potenciais microrganismos patogénicos, incluindo o microrganismo-alvo, em amostras com uma carga viral ≥10.⁵ cópias/ml ou um valor de Ct ≤ 24,5, o sequenciamento macro-genómico é a abordagem recomendada.
• Ao focar-se exclusivamente nos microrganismos-alvo e lidar com amostras desafiadoras (carga viral <10)⁵ cópias/ml ou Ct >24,5), a sequenciação por captura de sonda é preferível para detectar mutações de base menores e frequências, enquanto a sequenciação de amplicões por PCR multiplex é aconselhada para capturar mutações de base maiores.
• Para a análise direcionada do microorganismo específico, priorizando as principais mutações de base e trabalhando com amostras difíceis (cargas virais tão baixas quanto 10).² cópias/ml ou valores de Ct tão altos quanto 35), o sequenciamento de amplicons de PCR multiplex é o método recomendado.

Referência:

1. Liu, Yong-Xin, et al. "Um guia prático para a análise de amplicões e metagenómica de dados de microbioma." Proteína e célula 12,5 (2021): 315-330.