Sequenciação de Longo Alcance Abordando o Desafio do Haplótipo em Genomas de Câncer de Pulmão

A maioria dos estudos sobre genomas de cancro realizados até agora utilizou sequenciação de leituras curtas, que permitiu principalmente a identificação de alterações genómicas em pequena escala, como variantes de nucleótido único (SNVs) e inserções e deleções curtas (InDels). No entanto, os avanços recentes em tecnologias de sequenciação têm permitido a deteção de variantes estruturais genómicas (SVs) maiores em vários tipos de cancro. Espera-se que estas SVs tenham uma relevância biológica e clínica significativa.

As variantes estruturais envolvem rearranjos substanciais no genoma, como inversões e translocações cromossómicas. Estas alterações podem dar origem a genes de fusão oncogénicos, como BCR-ABL, EML4-ALK e KIF5B-RET. Deleções de grandes segmentos também são comuns em genes supressores de tumores, como TP53, RB1 e PTEN, levando à inativação da sua expressão e função.

Reconhecendo a importância dos SVs, A Análise Pan-Cancer de Todo o Genoma O consórcio concentrou-se na investigação de variações estruturais genómicas em grande escala, além de SNVs. O consórcio reportou assinaturas de SV para 38 subtipos de cancro diferentes, com o objetivo de melhorar a nossa compreensão dessas alterações em diversos tipos de cancro.

Embora os métodos analíticos convencionais possam inferir a presença de SVs a partir de dados de sequenciação de leituras curtas, muitas vezes fornecem apenas informações parciais sobre a estrutura completa dessas variantes. Para alcançar uma deteção mais precisa e abrangente de SVs, tecnologias de sequenciação de leitura longa deve ser utilizado. A sequenciação de leitura longa permite a geração de leituras extensas, possibilitando a observação direta e a caracterização precisa de rearranjos estruturais complexos dentro do genoma do câncer.

Ao utilizar sequenciação de leituras longas, os investigadores podem obter uma visão mais detalhada e holística das variantes estruturais genómicas, permitindo assim uma compreensão mais profunda das suas implicações funcionais e do seu potencial significado clínico na investigação do cancro.

Análise de Haplótipos Genómicos do Cancro do Pulmão

A pesquisa utilizou análise de haplótipos genómicos para investigar o câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) em 20 pacientes japoneses. Utilizaram tanto leituras longas como leituras curtas. sequenciação do genoma completo (WGS) dados para realizar uma análise de fase conjunta.

Para identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), os investigadores compararam os dados de segunda geração utilizando BWA-MEM e GATK. Eles usaram minimap2 para comparar as sequências de comprimento de leitura longo. Com base nos SNPs identificados, realizaram tipagem para elucidar a variabilidade das variações estruturais somáticas (SVs) e das variações de nucleotídeo único (SNVs) a nível de haplótipo.

O estudo mostrou que a haplotipagem baseada em Informação sobre SNP foi bem-sucedido, e aproximadamente 56% dos SNPs detectados no genoma normal foram atribuídos a blocos de haplótipos. A profundidade de sequenciação foi avaliada, e os resultados indicaram que a construção de haplótipos parecia saturar a uma profundidade de aproximadamente 20x-30x, com cerca de 5000 construções. O estudo concluiu que dados de sequenciação com uma profundidade mínima de 20x poderiam ser razoavelmente utilizados para análise de fase de tumor.

Para avaliar a precisão dos resultados de tipagem, os investigadores avaliaram especificamente a correlação dos blocos de haplótipos obtidos para dois SNPs dados. Os resultados demonstraram que a taxa de diferença entre os genomas tumorais e normais para esses dois SNPs era semelhante a descobertas anteriores, indicando uma precisão razoável. Além disso, ao comparar os resultados de tipagem com os de uma coorte japonesa saudável diferente, 98,7% das associações SNP-SNP eram consistentes. Isso sugere que a informação de fase obtida dos genomas tumorais e normais é precisa e pode servir como referência para uma análise mais aprofundada das mutações genómicas ao nível do haplótipo.

Análise de Haplotipos de 20 Genomas de Câncer

Em primeiro lugar, ao comparar os blocos de haplótipos dos tumores com os dos tecidos normais, observou-se que os blocos de haplótipos dos tumores tinham um número menor, mas eram mais longos em termos de N50 (uma medida de contiguidade). No entanto, continham um número semelhante de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) comparado com tecidos normais. Isto sugere que os genomas tumorais apresentavam blocos de haplótipos maiores e mais contíguos, provavelmente devido à expansão clonal das células tumorais e à perda de heterozigosidade nos genomas do câncer.

Em segundo lugar, a associação entre os blocos haplotípicos sequenciados e a profundidade de sequenciação ou o comprimento das leituras foi avaliada. Foi encontrado que a profundidade de sequenciação exibiu uma correlação positiva com o comprimento do bloco de fase. Isso sugere que uma maior profundidade de sequenciação aumenta a probabilidade de obter blocos haplotípicos mais longos. Além disso, foi detectada uma forte correlação entre o comprimento das leituras individuais e o comprimento dos blocos de fase construídos. Isso implica que o comprimento das leituras individuais desempenha um papel mais significativo na determinação dos blocos de fase resultantes em comparação com a profundidade de sequenciação.

Além disso, a geração precisa de blocos de haplótipos foi avaliada em todos os 20 casos. Os resultados mostraram que, em média, 78% das regiões genómicas contribuíram para os blocos faseados. Isso indica que uma parte significativa do genoma poderia ser faseada com precisão. No entanto, os 22% restantes dos blocos faseados, referidos como regiões de baixa cobertura, não puderam ser adequadamente cobertos. Essas regiões de baixa cobertura estavam principalmente associadas a regiões caracterizadas por SNPs de baixa heterozigose, sugerindo que a presença de regiões de baixa diversidade ou homozigóticas apresenta desafios para uma faseação precisa de haplótipos.

No geral, estas descobertas destacam o impacto da profundidade de sequenciação e do comprimento das leituras na geração de blocos de haplótipos e enfatizam a influência das características do tumor na composição e contiguidade dos haplótipos em genomas de câncer.