O que é o Sequenciamento CUT&RUN e como se compara ao CUT&Tag?

Atualmente, a investigação epigenética enfrenta novos desafios, como a resolução a nível de célula única, o rastreamento de processos dinâmicos e a compatibilidade com amostras clínicas. Por exemplo, a distribuição dinâmica de marcadores de heterocromatina durante o desenvolvimento embrionário depende das características de alta resolução do CUT&RUN, enquanto as quantidades traço em amostras de biópsia clínica são mais adequadas à vantagem de baixo volume inicial. CUT&Tag. Este artigo tem como objetivo rever sistematicamente os princípios técnicos, as principais diferenças e os cenários aplicáveis do CUT&RUN e do CUT&Tag, fornecendo aos investigadores uma referência para selecionar métodos apropriados com base no tipo de proteína alvo, no estado da cromatina e nas necessidades experimentais, promovendo a investigação epigenética em direção a uma maior precisão e uma aplicabilidade mais ampla.

Comparação de Princípios e Tecnologias

Sequenciação CUT&RUN: Princípios e Características

CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) é uma técnica de análise de cromatina direcionada por anticorpos. Utiliza a nuclease micrococcal (MNase) para clivar o DNA próximo ao local de ligação da proteína alvo e liberar diretamente o fragmento para sequenciação.

• Os seus passos principais incluem:
  • Fixação e permeabilização celular: Células vivas são ligadas utilizando esferas magnéticas de concanavalina A (ConA), e a permeabilização da membrana celular é alcançada utilizando digitina, eliminando a necessidade de entrelaçamento com formaldeído.
  • Incubação de anticorpos: Anticorpos específicos visam e ligam-se à proteína alvo (como modificadores de histonas ou fatores de transcrição) e são recrutados para o local de ligação à cromatina pela enzima pA-MNase, uma enzima de fusão de proteína A/G.
  • Clivagem por MNase: Após a ativação por Ca²⁺, a MNase cliva o DNA que flanqueia a proteína alvo, liberando um fragmento de aproximadamente 300-500 bp que difunde para a região extranuclear.
  • Purificação de DNA e Construção de Bibliotecas: O DNA é purificado diretamente, reparado nas extremidades, com cauda A e ligado a adaptadores de sequenciação sem a necessidade do passo de disruptura por sonicação tradicional. ChIP.
• Vantagens:
  • Alta Resolução: A localização do sítio de ligação é precisa a ±50 bp, tornando-a particularmente adequada para pesquisas sobre fatores de transcrição pioneiros (como o CTCF).
  • Adequação do Heterocromatina: As enzimas MNase têm um baixo peso molecular e conseguem cleavar eficientemente regiões de heterocromatina densamente compactadas (como os locais de modificação H3K9me3), tornando-as adequadas para cenários complexos, como o desenvolvimento embrionário.
  • Baixo Ruído de Fundo: Elimina a necessidade de interrupção por sonicação, reduzindo a interferência de quebras aleatórias de DNA.

Desempenho geral de "CUT&RUN em placa" (Miura M et al., 2020)

CUT&Tag: Inovação Tecnológica e Processo Simplificado

CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) é uma melhoria em relação ao CUT&RUN, utilizando a proteína de fusão pA-Tn5 transposase para completar simultaneamente a clivagem de DNA e a adição de adaptadores de sequencia, simplificando significativamente os procedimentos experimentais.

• O seu fluxo de trabalho inclui:
  • Incubação de Anticorpos: As células são imobilizadas utilizando esferas magnéticas de concanavalina A, e os anticorpos visam e ligam-se à proteína alvo.
  • Transposição Tn5: Após ativar a transposase, o DNA é diretamente clivado no local alvo e os adaptadores de sequenciação são inseridos.
  • Amplificação de Bibliotecas: Não é necessário reparo de extremidades; as bibliotecas de sequenciamento são geradas diretamente através da amplificação por PCR.
• Vantagens:
  • Operação Fácil: Elimina etapas de entrelaçamento e sonicação, encurtando o ciclo experimental para 1 dia.
  • Baixo Volume Inicial: Apenas 500-50.000 células são necessárias, e até a análise de células únicas é suportada.
  • Alto Rácio Sinal-Ruído: A clivagem direcionada reduz o fundo não específico, resultando numa taxa de validade dos dados superior a 80%.

Diferenças Técnicas Entre CUT&RUN e CUT&Tag

Análise das Principais Diferenças

• Penetração da Membrana Nuclear e Estado da Cromatina:
  • CUT&RUN fixa células vivas usando esferas magnéticas de ConA, e a MNase apenas corta os locais de ligação da proteína alvo, proporcionando uma forte penetração na heterocromatina (por exemplo, H3K9me3).
  • O CUT&Tag baseia-se na transposase Tn5, que prefere a cromatina aberta e pode ter cobertura insuficiente da heterocromatina, o que pode levar a falsos negativos.
• Controlo de Ruído de Fundo:
  • CUT&RUN utiliza a clivagem precisa de MNase, libertando apenas o DNA do local-alvo e resultando em sinais de fundo muito baixos.
  • A transposase Tn5 do CUT&Tag pode clivar regiões não-alvo, exigindo a otimização de anticorpos e condições de reação para reduzir o ruído.

Principais Diferenças: Cenários de Aplicação e Limitações

(1) Detecção de Modificações de Histonas de Heterocromatina

• CUT&RUN é superior: a MNase pode clivar regiões de heterocromatina, enquanto a enzima Tn5 no CUT&Tag tem dificuldade em clivar efetivamente a cromatina fechada devido a obstáculos estéricos. Por exemplo, pesquisas de Ruimin Xu et al. mostram que a distribuição dinâmica de H3K9me3 no desenvolvimento embrionário humano depende do CUT&RUN.

• Limitações do CUT&Tag: a enzima Tn5 prefere a cromatina aberta, resultando em cobertura insuficiente da heterocromatina, o que pode levar a resultados falso negativos.

Esquema da preparação de amostras e CUT&RUN de modificações de histonas em embriões humanos pré-implantação (Xu R et al., 2022)

(2) Resolução de Locais de Ligação de Fatores de Transcrição

• CUT&RUN tem uma resolução mais elevada: a clivagem por MNase produz fragmentos de DNA mais curtos com limites de locais de ligação mais claros, tornando-o particularmente adequado para o estudo de fatores de transcrição pioneiros. Por exemplo, a eficiência de enriquecimento do CUT&RUN-qPCR é 10 vezes superior à do ChIP-qPCR tradicional.

• Aplicabilidade do CUT&Tag: Funciona bem para a maioria dos fatores de transcrição (como a RNA polimerase II), mas a resolução é relativamente baixa (aproximadamente 200-500 bp).

(3) Complexidade Experimental e Custo

• O CUT&Tag é mais simples: não são necessários passos de preparação e reparação da biblioteca, tornando-o adequado para processamento de amostras em alta capacidade.

• CUT&RUN é ligeiramente mais caro: é necessária uma otimização adicional da atividade de MNase e da ligação de adaptadores, mas a qualidade dos dados é mais estável.

Recomendações

Cenários onde o CUT&RUN é preferido

É necessária uma localização de alta resolução dos locais de ligação dos fatores de transcrição.

Por exemplo, Miura M et al. utilizaram a tecnologia CUT&RUN para analisar as características de ligação da cromatina da RNA polimerase II (Pol II) na linha celular de cancro do pulmão humano A549, revelando o significado biológico único de duas estruturas de ligação diferenciais da Pol II perto do local de início da transcrição (TSS) e pegadas de DNA curtas. As principais conclusões são as seguintes: Usando CUT&RUN (direcionado para as pegadas de reconhecimento da proteína de clivagem de DNA da nuclease micrococcal) como ferramenta, foi analisada a distribuição da Pol II nas células A549:

• Fragmentos longos (>270 bp): Correspondem a uma distribuição bimodal em torno do TSS (semelhante aos resultados clássicos de ChIP), representando Pol II pausada (ligada a complexos como NELF, e sendo arrestada após a iniciação da transcrição);

• Fragmentos curtos (< 120 bp): Representando aproximadamente 5% das leituras totais, mas um pico claro pode ser identificado no TSS—esta é uma localização transitória da Pol II antes da pausa perto do promotor (não detetada por ChIP convencional). Alguns fragmentos curtos podem também corresponder a "início abrupto" (a Pol II é libertada do local de início, mas não consegue prolongar a transcrição).

• Significado

• As impressões únicas de fragmentos curtos (< 120 bp) revelam a localização transitória da Pol II perto do promotor, complementando os pontos cegos da ChIP clássica;

• A localização de grandes impressões digitais (fragmentos longos) está correlacionada com a direcionalidade da transcrição, esclarecendo o valor funcional de diferentes impressões digitais CUT&RUN.

Hipótese de trabalho sobre as pegadas da Pol II e a pausa da Pol II (Miura M et al., 2020)

Análise de Marcadores de Heterocromatina

Por exemplo, Yang H et al. utilizaram CUT&RUN para localizar modificações de histonas em todo o genoma e descobriram que a deficiência de Brd4 levou a um aumento global nos níveis de enriquecimento de dois marcadores de cromatina ativa (H3K122ac: relacionado à transcrição ativa; H3K4me3: marcador de promotor ativo) em HSCs/HPCs. Esta alteração coincidiu com a regulação positiva da expressão de genes relacionados ao envelhecimento. Este resultado revela o mecanismo pelo qual Brd4 mantém a função de HSC/HPC e previne o envelhecimento ao regular modificações de histonas (inibindo o sobre-enriquecimento de H3K122ac/H3K4me3).

Cenários Prioritários para CUT&Tag

Tamanho de amostra limitado ou necessidade de ciclos experimentais rápidos

Por exemplo, Wu SJ et al. utilizaram a tecnologia scCUT&Tag para realizar uma análise do panorama de cromatina a nível de célula única de modificações específicas de histonas (H3K27me3).

• Diferenciação de tipos celulares e geração de paisagens PcG: a análise scCUT&Tag de H3K27me3 pode diferenciar tipos celulares sanguíneos humanos, gerando paisagens PcG específicas de tipo celular a partir de tecidos heterogéneos.

• Análise da heterogeneidade tumoral:
  • A análise de H3K27me3 em pacientes com tumores cerebrais antes e após o tratamento (incluindo amostras de recidiva) identificou tipos celulares e heterogeneidade da atividade PcG no microambiente tumoral;
  • Quatro tipos de células foram identificados em amostras de recidiva, revelando um enriquecimento do cluster T1 (semelhante ao cluster T1 em tumores primários). Nos clusters celulares resistentes a fármacos, o genoma preneuronal (Verhaak_glioblastoma_proneural) foi silenciado, e a paisagem PcG aproximou-se de um estado semelhante ao de células-tronco (não terminalmente diferenciadas).

Estudos sobre modificações de histonas em regiões de cromatina aberta

Por exemplo, Xie B et al. utilizaram a tecnologia CUT&Tag para detectar o papel regulador da lactilação da histona H3K18 (H3K18la) no câncer da bexiga, descobrindo que:

• H3K18la está enriquecido nas regiões promotoras de numerosos genes;

• A sequenciação CUT&Tag revelou que os genes relacionados com H3K18la são ricos em múltiplas vias de sinalização que regulam a tumorigenese, indicando que H3K18la desempenha um papel crucial na progressão do câncer de bexiga humano.

• A região do promotor LCN2 está enriquecida com H3K18la;

• Inibidores da glicólise ou a superexpressão de circXRN2 podem reduzir a interação entre H3K18la e o promotor LCN2, verificando o papel regulador chave de H3K18la na transcrição de LCN2 (confirmado por subsequente Experimentos de ChIP).

Resumo

Tanto o CUT&RUN como o CUT&Tag revolucionaram os paradigmas da pesquisa em cromatina, mas cada um tem o seu próprio enfoque:

• CUT&RUN: Destaca-se na alta resolução e compatibilidade com heterocromatina, tornando-se o "padrão ouro" para estudos epigenéticos complexos.

• CUT&Tag: As vantagens incluem facilidade de uso e baixas quantidades iniciais, tornando-o a ferramenta preferida para a análise rotineira de modificações de histonas.

Os dois são complementares em vez de intercambiáveis; os investigadores devem escolher de forma flexível com base no tipo de proteína alvo, nas características da amostra e nos requisitos experimentais.

As pessoas também perguntam

Qual é a diferença entre CUT&RUN e CUT&Tag?

CUT&RUN utiliza pAG-MNase ativada por Ca2+ para clivar o DNA, enquanto CUT&Tag utiliza pAG-Tn5 ativada por Mg2+ para clivar o DNA.

O que é sequenciação CUT&RUN?

CUT&RUN é uma técnica de perfilagem de cromatina direcionada por anticorpos que corta o DNA in situ dentro de núcleos permeabilizados, permitindo um mapeamento de alta resolução das interações proteína-DNA com baixo ruído de fundo e mínima entrada celular.

Quais são as vantagens do CUT&RUN em relação ao ChIP-seq?

CUT&RUN oferece vantagens chave em relação ao ChIP-seq, incluindo menor ruído de fundo, maior resolução, protocolo mais rápido e requisitos de entrada celular significativamente reduzidos.

Qual é a diferença entre CUT&Tag e seq ATAC?

ATAC-Seq permite aos investigadores detectar as localizações de cromatina aberta, nucleossomas e fatores de transcrição ocupados utilizando Tn5 carregado com adaptadores. CUT&Tag revela interações proteína-cromatina utilizando um anticorpo alvo e pA-Tn5 carregado com adaptadores.

Referências

1. Miura M, Chen H. CUT&RUN deteta impressões digitais distintas de DNA da RNA polimerase II perto dos locais de início de transcrição.. Pesquisa de Cromossomos. Dez 2020;28(3-4):381-393.
2. Xu R, Li S, Wu Q, Li C, Jiang M, Guo L, Chen M, Yang L, Dong X, Wang H, Wang C, Liu X, Ou X, Gao S. A ocupação específica de H3K9me3 garante o silenciamento de retrotransposões em embriões humanos pré-implantação.. Células-Tronco da Célula. 2022 Jul 7;29(7):1051-1066.e8.
3. Yang H, Sui P, Guo Y, Chen S, Maloof ME, Ge G, Nihozeko F, Delma CR, Zhu G, Zhang P, Ye Z, Medina EA, Ayad NG, Mesa R, Nimer SD, Chiang CM, Xu M, Chen Y, Yang FC. A perda de BRD4 induz senescência celular em HSC/HPCs ao desregular o corte da histona H3.. EMBO Rep. 2023, 9 de outubro; 24(10):e57032.
4. Wu SJ, Furlan SN, Mihalas AB, Kaya-Okur HS, Feroze AH, Emerson SN, Zheng Y, Carson K, Cimino PJ, Keene CD, Sarthy JF, Gottardo R, Ahmad K, Henikoff S, Patel AP. Análise CUT&Tag de célula única de modificações de cromatina na diferenciação e progressão tumoral. Nat Biotechnol. Jul 2021;39(7):819-824.
5. Xie B, Lin J, Chen X, Zhou X, Zhang Y, Fan M, Xiang J, He N, Hu Z, Wang F. CircXRN2 suprime a progressão tumoral induzida pela lactilação de histonas através da ativação da via Hippo no câncer de bexiga humano.. Câncer Molécula. 2023 Set 8;22(1):151.