O Guia Definitivo para Sequenciação de eccDNA: Definições vs ecDNA, Fluxos de Trabalho em Câncer e Recursos de Atlas Interespécies

O DNA circular extracromossómico (eccDNA) passou de uma curiosidade para um alvo de pesquisa prático em oncologia, biologia do desenvolvimento e genómica vegetal. Este guia traz clareza em três eixos: (1) definições e distinções precisas entre eccDNA e ecDNA; (2) fluxos de trabalho de deteção e sequenciação focados no câncer, abrangendo laboratório molhado e bioinformática; e (3) navegação em atlas/base de dados interespécies. O objetivo é ajudar a montar experimentos e análises rigorosas sem confundir pequenos eccDNA com grandes ecDNA oncogénicos.

Principais conclusões

• Use "eccDNA" para descrever pequenos fragmentos de DNA circular e "ecDNA" para grandes círculos oncogénicos (≈0,1–10 Mb); eles diferem em tamanho, conteúdo genético e comportamento.
• Para sequenciação de eccDNALeituras curtas destacam-se na deteção de pontos de interrupção em fluxos de trabalho de enriquecimento (por exemplo, Circle-Seq), enquanto leituras longas são essenciais para reconstruir grandes estruturas de ecDNA.
• Um fluxo de trabalho robusto remove DNA linear (exonucleases), amplifica círculos (RCA phi29), valida junções (PCR/Sanger) e confirma estrutura/localização (FISH, mapeamento de leitura longa ou óptico).
• Bases de dados recentes (por exemplo, eccDNABase, scEccDNAdb) oferecem entradas multi-espécies e contextos de célula única; aproveite-as para verificar resultados e planear experiências.

eccDNA vs ecDNA: terminologia clara e principais diferenças

A confusão entre eccDNA e ecDNA leva a interpretações erradas. O eccDNA geralmente denota moléculas de DNA circular menores que surgem de fragmentos cromossómicos e aparecem em tecidos normais e cancerígenos, enquanto o ecDNA refere-se a amplicons circulares grandes (≈0,1–10 Mb) enriquecidos em cânceres, frequentemente contendo oncogenes intactos e elementos reguladores. Revisões autorizadas delineiam esses limites, incluindo a visão geral de eccDNA de 2024 por Wang e colegas e a síntese de 2024 da Frontiers in Genetics por Zhou e co-autores. Para a prevalência e implicações do ecDNA, o guia de 2025 de Weiser e co-autores sobre Cancer Discovery agrega evidências pan-cancerígenas.

As leituras de apoio com métodos e definições incluem a revisão de acesso aberto de Wang de 2024 na PMC e o artigo de Zhou de 2024 na Frontiers in Genetics sobre métodos de identificação, enquanto o papel do ecDNA no câncer é sintetizado na revisão de Weiser de 2025 na Cancer Discovery.

Como se forma o eccDNA e por que é importante

Os mecanismos abrangem as vias de dano e reparação do DNA:

• A junção de extremidades mediada por microhomologia (MMEJ) e a junção alternativa de extremidades podem circularizar fragmentos em tratos de microhomologia.
• A junção de extremidades não homólogas (NHEJ) e a recombinação homóloga (HR) produzem círculos em contextos de quebras de dupla fita.
• Eventos catastróficos como a cromotripse e os ciclos de quebra-fusão-ponte geram grandes amplicões que podem circularizar em ecDNA.

Estes modelos afetam a deteção. Por exemplo, as junções ricas em microhomologia favorecem a descoberta de leituras divididas em conjuntos de dados de leituras curtas, enquanto o ecDNA complexo e repetitivo frequentemente exige resolução de leituras longas e reconstrução baseada em grafos. Sínteses de métodos recentes e contexto histórico são resumidos em revisões de 2024–2025, incluindo a visão geral de Theranostics de 2025.

Caixa de ferramentas de deteção: etapas de laboratório, controlo de qualidade e armadilhas comuns

Um confiável detecção de eccDNA o fluxo de trabalho remove DNA linear, aumenta a abundância de DNA circular e valida estruturas antes da sequenciação.

• Digestão de exonuclease de DNA linear

  • A DNase Plasmid‑Safe (PSD) degrada seletivamente DNA linear antes da amplificação em círculo rolante (RCA). Tenha em mente os círculos com cortes que podem ser vulneráveis a algumas nucleases; uma visão geral de 2024 descreve as escolhas de enzimas e precauções.
  • Os fluxos de trabalho da exonuclease V RecBCD utilizam digestões em série (frequentemente até 48 horas) com inativação por calor; a qPCR de marcadores nucleares (por exemplo, HBB) e mitocondriais (por exemplo, MT-CO1/ND5) pode monitorizar a depleção.

• Depleção de DNA mitocondrial

  • Se o carryover de mtDNA for elevado, estratégias para linearizar e digerir mtDNA (endonucleases ou cortes guiados por CRISPR) podem reduzir o ruído antes da RCA, conforme resumido nas revisões de métodos de 2024-2025.

• Amplificação em círculo rolante (phi29)

  • RCA isotérmica usando phi29 aumenta o DNA circular. Note a tendência para círculos pequenos; planeie uma validação ortogonal para candidatos maiores.

• Enriquecimento Circle-Seq e sequenciação de leituras curtas

  • Os passos típicos incluem tratamento alcalino e separação em coluna, digestão PSD, RCA phi29, preparação da biblioteca e sequenciação de extremidades pareadas. Seguem-se bioinformática centrada em junções (leituras divididas e pares discordantes).

• Centrifugação em gradiente de densidade CsCl–EtBr

  • Em amostras com maior abundância de círculos, a separação por densidade de flutuação pode enriquecer ainda mais os círculos, frequentemente acompanhada de exonucleases.

Destaques de QC e resolução de problemas:

• Verifique a remoção de DNA linear por qPCR antes da RCA para reduzir artefatos.
• Valide círculos putativos através de PCR para fora/inversa e sequenciação Sanger das junções.
• Se o mtDNA dominar as leituras, adicione depleção direcionada ou ajuste a extração para reduzir o DNA organelar.

Para práticas gerais de qualidade de ácidos nucleicos aplicáveis a fluxos de trabalho de DNA, consulte este guia prático sobre extração e controlo de qualidade da nossa base de conhecimento: O Guia Mais Abrangente para a Extração de RNAOs seus princípios sobre rendimento, pureza e integridade traduzem-se bem em contextos de ADN.

Estratégias de sequenciação para sequenciação de eccDNA: leituras curtas vs longas e quando usar cada uma.

A escolha de uma plataforma depende do tamanho do círculo, da resolução estrutural necessária e do orçamento.

• Leituras curtas da Illumina (150–300 pb PE)

  • Forças: alta precisão base; deteção sensível de pequenos eccDNA; mapeamento preciso de pontos de quebra através de leituras divididas e pares discordantes. As sínteses de métodos, incluindo a revisão de Teranósticos de 2025, discutem estas vantagens.
  • Limitações: baixa resolução para círculos grandes/repetitivos; a reconstrução completa de ecDNA complexo é frequentemente inviável sem suporte de leituras longas.

• Leituras longas HiFi da PacBio (10–25 kb+) e Leituras longas da Oxford Nanopore (dezenas a centenas de kb; viável ultra-longa)

  • Forças: captura longas extensões em repetições, permitindo a reconstrução de círculos grandes ou complexos e ecDNA; a ONT também oferece sinais de metilação nativos. As aplicações em contextos de biópsia líquida são resumidas por Si e colegas (2024).
  • Limitações: taxas de erro por leitura mais elevadas (especialmente ONT; mitigadas com consenso/polimento), requisitos de custo/entrada e a necessidade de validação ortogonal.

• Estratégias híbridas

  • Combine leituras curtas para precisão de junção com leituras longas para escoramento e reconstrução completa. Este é frequentemente o caminho pragmático para ecDNA suspeito.

As páginas de contexto que enquadram decisões de leituras curtas vs longas em transcriptómica também fornecem analogias úteis para o ADN: sobreposições de plataformas e primers de leituras curtas vs longas podem ajudar a estruturar o pensamento em torno da precisão, comprimento da leitura e compensações de rendimento. Serviço de Sequenciação de Transcriptoma e Análise de Dados e Sequenciação de cDNA de leitura curta vs leitura longa e sequenciação direta de RNA.

Pipelines de bioinformática: de leituras a chamadas de DNA circular

Um conjunto de ferramentas prático surgiu entre 2024 e 2026:

• eccDNA‑pipe integra FastQ brutos (WGS, Circle‑Seq ou Circulome-seq) com módulos de deteção (Circle‑Map ou AmpliconArchitect), e depois realiza anotação e visualização; veja a descrição de Fang e colegas em 2024 na Briefings in Bioinformatics.
• O Circle-Map deteta junções de eccDNA em conjuntos de dados de enriquecimento, fornecendo coordenadas e distribuições de tamanhos; esta abordagem será abordada em revisões metodológicas de 2024.
• O AmpliconArchitect (AA) reconstrói gráficos de amplicões focais em conjuntos de dados de WGS; o AmpliconClassifier (AC) categoriza estruturas (ecDNA/cíclico, BFB, HSR, complexo, linear). A validação cruzada com citogenética e leituras longas é recomendada; a revisão de Weiser de 2025 resume a utilização e desempenho do AA/AC.
• Recursos complementares como o CytoCellDB fazem chamadas em contextos de cariótipo e linhagem celular para apoiar a classificação e a geração de hipóteses.

Saídas a esperar:

• Coordenadas e tamanhos para pequenos eccDNA;
• Classes estruturais e número de cópias para ecDNA;
• Anotações genéticas e artefactos de visualização (gráficos de ponto de ruptura, gráficos de Manhattan, modelos 3D);
• Bandeiras de QC indicando confiança e estado de validação.

Bases de dados e navegação de atlas entre espécies

Vários recursos atualizados ajudam a explorar o ADN circular em tecidos e organismos:

• eccDNABase (2025, Biologia Molecular e Evolução) oferece entradas multi-espécies com opções de anotação e download; utilize filtros de espécies e exporte em formato BED/CSV onde disponível. Consulte a descrição da base de dados de 2025 no site da MBE.
• scEccDNAdb (2024, Oxford Academic Database) integra contextos de eccDNA de célula única para humanos e ratos; consulte o artigo da Base de Dados de 2024 para o link do portal e exemplos de consulta.
• Os conjuntos de dados do atlas de tecidos de ratos lançados em 2025 relatam distribuições de eccDNA através de tecidos e grupos etários, úteis para expectativas de referência.
• CytoCellDB (2024, NAR Cancer) foca nos cariótipos de linhas celulares cancerígenas e suporta previsões de ecDNA/HSR que complementam os resultados do AmpliconSuite.

Dicas práticas:

• Comece com consultas centradas em genes (oncogenes, genes de resposta ao stress) e depois mude para filtros de espécies e tecidos.
• Exporte entradas e acompanhe metadados (tipo de amostra, plataforma, profundidade) para evitar a generalização excessiva entre conjuntos de dados heterogéneos.

Validação focada no câncer: combinando evidências ortogonais

Nenhum método único é suficiente. Um conjunto de confirmação robusto inclui tipicamente:

• PCR das junções (para fora/inversa) seguido de sequenciação Sanger para confirmar a topologia circular e os pontos de ruptura exatos.
• FISH para visualizar padrões de localização e amplificação.
• Leitura longa (ONT/PacBio) ou mapeamento genómico óptico para resolver arquiteturas repetitivas e verificar modelos de ecDNA.

A combinação destes métodos aumenta a confiança e melhora a interpretabilidade para estudos funcionais subsequentes.

Genómica de plantas: evidências e adaptações de métodos

Os sistemas de plantas oferecem exemplos claros e validados, bem como considerações técnicas únicas.

• A caracterização do arroz (Oryza sativa) com Circle-Seq identificou dezenas de milhares de pequenos eccDNAs em vários tecidos, com condições ambientais a modularem a abundância; a maioria dos círculos situou-se na faixa de 200–400 bp, conforme relatado em um estudo de acesso aberto de 2024.
• Em Amaranthus palmeri, a resistência a herbicidas está associada a grandes replicons que transportam EPSPS e, em alguns casos, GS2; o DNA circular rearranjado suporta resistência dual, de acordo com um artigo da Plant Cell de 2025.

Notas de método para plantas:

• Adaptar a extração para gerir paredes celulares e metabolitos secundários; incluir etapas de limpeza para reduzir inibidores.
• Planeie a depleção de DNA organelar para limitar a contaminação de plastídeos/mitocôndrias.
• Utilize leituras longas e PCR de junção para validar estruturas; FISH em núcleos é viável em alguns tecidos.

Colocando tudo junto: um fluxo prático de ponta a ponta

Comece com a extração cuidadosa e controlo de qualidade para garantir DNA de alto peso molecular (especialmente se leituras longas estiverem planeadas). Remova DNA linear através de exonucleases e, quando necessário, deplete mtDNA. Amplifique círculos com RCA phi29 enquanto rastreia potenciais viés de tamanho. Escolha a sequenciação com base nos objetivos: leituras curtas Illumina para descoberta de pequenos eccDNA e mapeamento de pontos de ruptura; PacBio HiFi ou Nanopore para ecDNA grandes suspeitos e repetições complexas; abordagens híbridas quando tanto a precisão quanto a estrutura são necessárias. Analise os dados de enriquecimento com Circle‑Map ou eccDNA‑pipe; interrogar WGS para ecDNA usando AmpliconArchitect + AmpliconClassifier e apoiar classificações com contexto citogenético de CytoCellDB. Valide candidatos com PCR de junção/Sanger, imagem FISH e mapeamento de leitura longa ou óptico. Finalmente, faça uma referência cruzada dos achados em bases de dados como eccDNABase e scEccDNAdb para situar os seus resultados em uma paisagem mais ampla entre espécies.

Próximos passos e recursos

Divulgação: CD Genomics é o nosso produto. Ao planear escolhas de plataformas e o desenho do estudo, as páginas de visão geral das plataformas e os primers de leituras curtas vs longas podem ajudar a estruturar decisões sem impor uma única abordagem. Para os leitores interessados em paralelos entre ácidos nucleicos circulares, uma visão geral do circRNA-seq oferece um contexto útil. Recursos internos:

• Visão geral da plataforma: Serviço de Sequenciação de eccDNA

FAQ — Perguntas comuns sobre sequenciação de eccDNA

Q1 — Qual é a diferença entre eccDNA e ecDNA?

A1 — eccDNA refere-se a moléculas de DNA circular relativamente pequenas derivadas de fragmentos cromossómicos e comumente encontradas em tecidos normais e doentes; ecDNA denota amplicões circulares muito maiores (≈0,1–10 Mb) que frequentemente transportam oncogenes intactos e impulsionam a heterogeneidade tumoral e a resistência, conforme sintetizado em revisões recentes como Wang 2024 e Weiser et al. 2025.

Q2 — Quais são os passos essenciais em laboratório húmido para fluxos de trabalho de sequenciação de eccDNA?

A2 — Os passos principais são: extração cuidadosa (preservar DNA de alto peso molecular para leituras longas), remoção seletiva de DNA linear (por exemplo, DNase Plasmid-Safe ou RecBCD), depleção mitocondrial opcional, amplificação em círculo rolante (phi29) para protocolos enriquecidos e preparação da biblioteca ajustada à plataforma escolhida. Consulte a seção da caixa de ferramentas de deteção para pontos de verificação e as advertências do phi29/RCA resumidas em Wang 2024.

Q3 — Leituras curtas, leituras longas ou híbridas — qual devo escolher?

A3 — Utilize leituras curtas (Illumina) para a deteção sensível de pequenos eccDNA e mapeamento preciso de junções; escolha leituras longas (PacBio HiFi ou ONT) para resolver grandes arquiteturas de ecDNA repetitivas; combine ambas (híbrido) quando precisar de precisão nas junções e reconstrução completa da estrutura (veja a seção de estratégias de sequenciação e a estrutura da plataforma no guia).

Q4 — Quais ferramentas de bioinformática são recomendadas para dados de enriquecimento versus dados de WGS?

A4 — Para dados de enriquecimento/Circle‑Seq, ferramentas centradas em junções como Mapa Circular ou pipelines integrados como eccDNA‑pipe são comumente utilizados. Para a descoberta e reconstrução de ecDNA em WGS, use AmpliconArchitect + AmpliconClassificador e validar com montagens de leituras longas ou mapeamento óptico; veja Fang et al. 2024 para eccDNA-pipe e Weiser 2025 para uso de AA/AC.

Q5 — Como devo validar experimentalmente os círculos candidatos?

A5 — Uma pilha de validação mínima: PCR outward/inverso de junções com sequenciação Sanger (confirmação de topologia), FISH para localizar a amplificação em células, e sequenciação de longas leituras ou mapeamento óptico para confirmar arquiteturas maiores. A combinação de métodos aumenta a confiança; veja a seção de validação focada no câncer.

Q6 — Onde posso encontrar atlas de eccDNA de várias espécies e como posso consultá-los?

A6 — Comece com recursos selecionados, como eccDNABase (2025) para entradas de múltiplas espécies e scEccDNAdb (2024) para contextos de célula única. Consulte por gene, espécie ou coordenadas genómicas; exporte BED/CSV onde disponível e mantenha os metadados da amostra (plataforma, tecido, profundidade) para evitar generalizações excessivas entre estudos heterogéneos.

Q7 — Que considerações especiais se aplicam a amostras de plantas?

A7 — As plantas apresentam desafios de extração (paredes celulares, metabolitos secundários) e a contaminação por DNA organelar. Adapte os passos de extração e limpeza, incluindo a depleção de plastídeos/mitocôndrias, e valide com PCR de junção mais leituras longas ou FISH sempre que possível; exemplos de plantas validadas incluem o perfil de arroz e os casos de resistência de Amaranthus citados no guia (Zhuang 2024; Carvalho‑Moore 2025).

Q8 — Os métodos de enriquecimento comuns introduzem viés nas distribuições de tamanho dos círculos detetados?

A8 — Sim. Os protocolos RCA (phi29) e Circle‑Seq amplificam preferencialmente círculos menores, o que pode subrepresentar ecDNA maiores; gradientes de CsCl e abordagens de leitura longa reduzem esse viés para estruturas maiores. Interprete as distribuições de tamanho tendo em mente o viés do método (veja a caixa de ferramentas de Detecção e as estratégias de Sequenciação).

Q9 — Pode o eccDNA ser detetado de forma fiável em tipos de amostras clínicas (FFPE, plasma)?

A9 — É possível, mas mais desafiador: a fragmentação do DNA FFPE e a baixa abundância no plasma reduzem a sensibilidade e aumentam os artefatos. Otimize a extração, inclua controlos negativos rigorosos, considere o enriquecimento do alvo ou sequenciação mais profunda, e valide os candidatos de forma ortogonal (PCR/FISH/leitura longa) antes da interpretação.

Q10 — Como posso iniciar um projeto de sequenciação de eccDNA reproduzível?

A10 — Lista de verificação inicial chave: definir a questão biológica e o intervalo de tamanho alvo; selecionar enriquecimento versus WGS; planear a plataforma (curta, longa ou híbrida) e a profundidade estimada; incluir controlos de depleção de ADN linear e spike-ins; pré-definir métodos de validação (PCR, FISH, leituras longas); e registar metadados e parâmetros de análise para reprodutibilidade. Utilize a seção de Montagem do Fluxo de Trabalho Prático e os recursos internos de QC (por exemplo, o guia de extração de RNA) para práticas recomendadas transferíveis de amostras e QC: Guia de extração de RNA e controlo de qualidade.

Referência:

1. definições e métodos de eccDNA (2024): A revisão de acesso aberto de Wang sobre eccDNA
2. Métodos de identificação e terminologia (2024): Frontiers in Genetics revisão por Zhou e colegas
3. Prevalência de ecDNA em câncer e implicações (2025): Síntese de descoberta do câncer por Weiser e co-autores
4. Evolução do método e contexto da plataforma (2025): Visão geral de workflows de eccDNA em teranóstica
5. Base de dados multi-espécies (2025): eccDNABase sobre Biologia Molecular e Evolução
6. Base de dados de célula única (2024): scEccDNAdb na Base de Dados Académica de Oxford
7. Contexto citogenético para amplicões (2024): CytoCellDB na NAR Cancer
8. Perfilagem de eccDNA de arroz (2024): Estudo de acesso aberto relatando eccDNA em todo o tecido
9. Círculos de resistência de Amaranthus palmeri (2025): Artigo sobre replicons grandes em células vegetais