À medida que as tecnologias de sequenciação de alto rendimento avançam rapidamente, a nossa compreensão da microbiota sofre um contínuo aprimoramento. A sequenciação microbiana abrange uma variedade de amostras, desde os solos situados no topo de picos elevados até as camadas sedimentares no abismo do fundo do oceano. Esta diversidade permite a investigação dos impactos microbianos nas flutuações ambientais e a decifração de enigmas fisiológicos inerentes a diversos organismos. Para alcançar resultados de sequenciação significativos, a estrita adesão a procedimentos padronizados para a coleta e submissão de amostras é fundamental — um pré-requisito essencial para o sucesso das iniciativas de pesquisa.
Antes de submeter amostras para sequenciação, é crucial considerar os seguintes pontos:
Esterilização de Ferramentas e Recipientes de Amostragem: Garantir que as ferramentas e recipientes utilizados para amostragem tenham sido devidamente esterilizados.
Rotulagem e Registo Oportunos: Rotule imediatamente as amostras após a recolha e mantenha registos detalhados das informações relevantes da amostragem.
Cópia de Segurança das Amostras Antes da Submissão: Crie cópias de segurança das amostras antes da submissão para proteger contra circunstâncias imprevistas que possam levar à perda de espécimes valiosos.
Utilização de Contentores Padrão para Submissão de Amostras: Utilize contentores padrão para a submissão de amostras, garantindo uma rotulagem clara e precisa. Evite quantidades excessivas de amostras durante a submissão.
Manter Condições de Baixa Temperatura durante o Transporte: Durante o transporte, mantenha um ambiente de baixa temperatura. Recomenda-se o uso de gelo seco para o envio.
Atenção a estes detalhes é essencial para garantir a integridade e a análise bem-sucedida das amostras no contexto do sequenciamento microbiano.
Para diferentes tipos de amostras ambientais, os métodos recomendados para a submissão de amostras são os seguintes:
Amostras Ambientais:
(1) Solo ou Sedimento:
Cole 5-10g de solo, removendo os detritos da superfície.
Extraia solo de uma profundidade de 5-10 cm, combinando amostras de pelo menos três pontos de coleta para cada espécime.
Coloque a amostra composta em tubos de centrífuga estéreis.
Transporte as amostras de volta para o laboratório a temperaturas abaixo de 0°C e armazene a -80°C.
Para amostras de sedimentos com maior teor de humidade, colete um mínimo de 50g.
É aconselhável utilizar recipientes que não excedam o tamanho de tubo de centrífuga de 15mL para amostras de solo.
(2) Água:
Utilize membranas de filtro de 0,22µm ou 0,45µm para filtração.
Filtrar volumes de água entre 5-10L, com uma área de membrana de filtro ótima de 3-4cm.
Armazene a membrana de filtro a -80°C.
Evite o envio direto de recipientes difíceis de abrir, como suportes de filtro, pois isso pode complicar a recuperação de amostras durante os experimentos e pode afetar os prazos do projeto.
Para amostras de água originais, recomenda-se enviar em tubos de centrifugação de 50mL. Se a amostra de água exceder 50mL, por favor, filtre-a você mesmo e envie a membrana do filtro.
Amostras de Plantas:
(1) Microbiota da Rizosfera:
Colete solo da rizosfera a uma profundidade de 20 cm e coloque-o em tubos estéreis de 50 mL.
Passe o solo por uma peneira de 20 malhas para remover raízes de plantas, restos de animais e outras impurezas.
Coloque 3-5g por tubo, feche imediatamente e congele rapidamente em azoto líquido.
(2) Superfície da Folha:
Colete 50-100g de material vegetal e lave com água estéril.
Após a lavagem, filtre a água estéril através de um filtro de membrana, preservando a membrana do filtro a -80°C.
(3) Micróbios Endofíticos:
Use PBS para remover bactérias da superfície.
Corte o tecido da planta, libertando microrganismos endofíticos.
Coloque o material vegetal em água com pérolas de vidro e agite.
Filtre a suspensão através de uma membrana de filtro de 5µm.
Centrifugar o filtrado (15000rpm, 4°C) para recolher o precipitado microbiano.
Colete os micróbios em criotubos importados e armazene a -80°C.
Devido à suscetibilidade dos micróbios endofíticos à contaminação das células hospedeiras, os ácidos nucleicos extraídos podem conter uma quantidade significativa de DNA do hospedeiro. Devem ser tomadas medidas cuidadosas para abordar a potencial contaminação do hospedeiro durante o processo de extração de ácidos nucleicos.
Amostras Fecais e Intestinais:
(1) Amostras Fecais Humanas:
Cole aproximadamente 3g (cerca do tamanho de uma soja) de material fecal.
Para evitar contaminação, recomenda-se descartar a urina e usar uma colher estéril para recolher amostras internas das fezes.
(2) Amostras Fecais de Rato:
Colete 0,5g (3 pastilhas) de material fecal de ratos.
Coloque os ratos numa gaiola limpa forrada com papel de filtro desinfetado e colete amostras de fezes imediatamente após a defecação.
Utilize papel de filtro fresco para cada rato para evitar a contaminação cruzada.
Após a recolha das amostras, coloque-as rapidamente em criotubos importados e congele-as rapidamente em azoto líquido. Em seguida, armazene-as a -20°C e, para armazenamento a longo prazo, transfira-as para -80°C. Recomenda-se enviar amostras fecais em tubos contendo solução protetora para preservar a integridade da amostra durante o transporte.
(3) Conteúdos Intestinais: Para a recolha de conteúdos intestinais:
Utilize um bisturi cirúrgico estéril para fazer uma incisão longitudinal ao longo do trato digestivo.
Recupere o conteúdo do trato digestivo e coloque-o em criotubos importados.
Congele imediatamente as amostras em azoto líquido e armazene-as a -80°C.
Para animais grandes ou de tamanho médio, como gado, ovelhas, grandes ratos e coelhos, colete 200-1000mg por amostra. Para animais pequenos, como ratos, colete 200-500mg por amostra. Para animais com conteúdos intestinais limitados, como peixes e camarões, colete pelo menos 100mg por tubo.
Amostras orais
(1) Saliva:
Utilize um coletor de saliva designado.
Instruir o indivíduo a expectorar saliva para o coletor 2-3 vezes (aproximadamente 1mL por expectoração).
Adicione estabilizador de DNA à saliva coletada.
Transfira a mistura para criotubos importados, congele rapidamente em azoto líquido e submeta para análise.
(2) Placa Dentária:
Coloque fio dental entre os dentes adjacentes para remover a placa interdental.
Utilize um cotonete estéril para recolher placa da superfície oclusal dos dentes posteriores.
Após a recolha, coloque as amostras em tubos de amostragem contendo uma solução conservante.
Agite rapidamente durante 30 segundos e as amostras podem ser enviadas à temperatura ambiente.
Dispositivo de Coleta de DNA Salivar
Amostras de tecido
(1) Mucosa Intestinal:
Selecione segmentos de diferentes partes do intestino.
Faça uma incisão vertical no segmento intestinal oposto ao mesentério para expor o lúmen intestinal.
Utilize um amostrador estéril para recolher amostras do conteúdo intestinal, armazenando-as separadamente.
Após limpar o conteúdo intestinal, enxague o lúmen intestinal com solução salina estéril para remover conteúdos intestinais visíveis (para evitar perturbar a mucosa).
Raspe suavemente a mucosa intestinal com uma lâmina de vidro estéril (evitando a penetração da membrana basal).
O tamanho da amostra deve ser aproximadamente o tamanho de uma unha (cerca de 0,8 cm * 0,8 cm).
Preserve as amostras em criotubos importados, congelando rapidamente com azoto líquido e armazenando a -80°C.
Tumor Gástrico:
Empregue métodos como a técnica da fístula ruminal, inserção de um tubo gástrico pela boca ou nariz, ou métodos de punção para coletar conteúdo gástrico.
Após passar por quatro camadas de gaze estéril para filtração, colete o fluido gástrico e armazene-o a -80°C.
(3) Sangue:
Limpe o local da venopunção com álcool a 70% e aguarde pelo menos 60 segundos.
Realize uma venopunção e retire 2 mL de sangue total para um tubo com anticoagulante EDTA.
Inverta o tubo anticoagulante 8-10 vezes para misturar bem o EDTA e o sangue total, garantindo uma anticoagulação eficaz.
Armazenar a -20°C.
(4) Pele:
Evite tomar banho 24 horas antes da colheita e evite usar hidratantes ou sabonetes antibacterianos.
Selecione uma área de aproximadamente 4 cm * 4 cm (cerca do tamanho de seis miniaturas) para amostragem.
Raspe suavemente a superfície da pele utilizando uma lâmina cirúrgica estéril.
(5) Amostras de Urina:
Coletar urina matinal em jejum, com ou sem hematúria.
As fêmeas devem evitar a colheita durante a menstruação e prevenir que secreções vaginais contaminem a urina.
Cole uma quantidade adequada de urina de meio fluxo aleatória, de preferência 3 mL ou mais, e armazene por congelação rápida em nitrogênio líquido.
(6) Amostras do Trato Reprodutivo:
Evite atividades sexuais durante 48 horas e abstenha-se de alterar a estrutura microbiana, como limpeza da área íntima ou uso de medicação, durante 30 dias.
Utilize um cotonete estéril para amostrar adequadamente, mergulhe-o em 2 mL de solução PBS num criotubo importado, descarte o cotonete e congele rapidamente em azoto líquido.
Devido à dificuldade em obter amostras de tecido, assegure-se de usar gelo seco para o envio ao enviar amostras de tecido.
Outros Tipos de Amostras:
(1) Microbiota Superficial em Objetos:
Coloque o objeto num recipiente estéril, adicione uma quantidade apropriada de PBS para submergir o objeto.
Utilize equipamento como um agitador para rodar e agitar, desalojando a microbiota superficial do objeto.
Colete a amostra de água, realize a centrifugação a alta velocidade a baixa temperatura e colete o precipitado num criotubo importado.
Armazenar a -80°C.
(2) Alimentos Fermentados:
Determine o volume da amostra com base em considerações de desenho experimental.
Devido à natureza única dos alimentos fermentados, a amostra deve ser embalada em um recipiente estéril e selado.
Armazenar a -80°C.
Resumo:
Garantir práticas de amostragem e entrega padronizadas é crucial para manter a qualidade das amostras, garantindo, em última análise, resultados desejáveis nas fases subsequentes de extração, construção de bibliotecas e análise.
No âmbito da investigação microbiológica, a CD Genomics oferece serviços abrangentes que incluem diversidade microbiana, metagenómica, e sequenciação metatranscriptómica análises:
Diversidade Populacional: Principalmente realizada através de Sequenciação de 16S/18S/ITS, esta abordagem investiga os tipos e a abundância das comunidades microbianas dentro das amostras. Facilita a comparação das diferenças entre amostras e a sua significância a nível populacional, oferecendo informações sobre as variações entre as amostras.
Diversidade Funcional: Aproveitando o sequenciamento metagenómico ou metatranscriptómico, este serviço explora os tipos de genes, abundância e diferenças de expressão dentro das amostras. Investiga a evolução das comunidades microbianas, as interações microbiais com o ambiente e as relações entre micróbios e hospedeiros, revelando e estudando novos genes funcionais.
Análise Multi-Estratégia Integrada: Ao combinar Sequenciação de 16S/18S/ITS, sequenciação metagenómica, sequenciação de metatranscriptómicae metabolómica, é alcançada uma exploração abrangente. Isto não só revela tipos microbianos e estruturas populacionais, mas também investiga profundamente as ligações entre função e expressão genética. Além disso, permite o estudo das respostas microbianas a mudanças ambientais a nível metabólico.
Sequenciação de Espécies Microbianas Únicas: Adaptado para micróbios cultiváveis, este serviço utiliza sequenciação do genoma completo de bactérias ou mapeamento fino de fungos para decifrar os genomas das espécies, fornecendo informações sobre as funcionalidades associadas às espécies.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
Diretrizes para Submissão de Amostras
