Utilização de Sequenciação de RNA para a Análise de Interacções Hospedeiro-Microbio

Dentro da intrincada interação entre células hospedeiras e bactérias comensais/patogénicas, o ambiente celular desempenha um papel fundamental na determinação do resultado final dessas interações. Isso inclui a ativação ou supressão de programas de virulência bacteriana, bem como o envolvimento de mecanismos de defesa do hospedeiro ou respostas de tolerância. Para obter uma compreensão abrangente dos princípios fundamentais subjacentes às interações hospedeiro-microbio em estados saudáveis e doentes, necessitamos de metodologias de alta resolução capazes de capturar suas dinâmicas intrincadas em várias escalas. Isso abrange investigações que vão desde o contexto mais amplo do organismo inteiro até as nuances das interações a nível de célula única, todas as quais contribuem para estabelecer uma base teórica robusta para a gestão de doenças associadas a micróbios.

Três Fases Evolutivas da Transcriptómica em Estudos de Interação Hospedeiro-Microbio

No domínio da biologia da infeção, os investigadores utilizam vários níveis de ensaios para explorar as interacções entre hospedeiros e micróbios, como genómica, epigenómicatranscriptómica, proteómica, metabolómica e mais. Entre estes, transcriptómica tem ganho uma tração significativa pela sua capacidade de oferecer uma visão geral da fisiologia celular, devido à sua sensibilidade, custo-efetividade e ampla aplicabilidade. Desde o início de sequenciação do transcriptoma no campo da biologia da infeção, há cerca de uma década, assistimos ao surgimento de três fases distintas na análise das interacções entre hospedeiros e micróbios.

Na fase inicial (Sequenciação de RNA de Lado Único/Estudo de Lado Único), as células hospedeiras e os micróbios estão fisicamente separados, com ênfase em examinar exclusivamente o hospedeiro ou o micróbio.

A segunda fase marca uma mudança crucial onde ambos os lados da interação são examinados simultaneamente. Esta fase abrange a caracterização das interações entre hospedeiro e micróbio (Dual RNA-Seq ou perfilagem de expressão dual) e aprofunda-se em metatranscriptómica para explorar a paisagem mais ampla do microbioma. Simultaneamente, houve uma reavaliação do papel dos transcritos não codificantes, que anteriormente eram considerados meros subprodutos da análise de RNA-seq. Estes transcritos não codificantes provaram ser inestimáveis na descoberta de insights cruciais sobre as interações entre hospedeiros e micróbios.

Na terceira e atual fase, assistimos à ascensão do sequenciamento do transcriptoma de células bacterianas unicelulares, uma técnica cada vez mais utilizada para desvendar a heterogeneidade inerente às interações entre hospedeiros e micróbios. Esta fase representa um avanço poderoso na nossa capacidade de analisar as dinâmicas intrincadas ao nível de células únicas dentro do componente microbiano dessas interações.

A história da investigação sobre infecções baseada em RNA-seq. (Westermann et al., 2021)

Métodos de Detecção para Interacções Hospedeiro-Microbio

• Investigar a estrutura e função da comunidade microbiana através de sequenciação do metatranscriptoma.
• Empregar sequenciação de RNA dual para analisar tanto o patógeno como o tecido do hospedeiro infectado.
• Conduzir RNA-seq triplo para dissecção de coinfecções virais e bacterianas ou simbiontes concorrentes com os seus hospedeiros.
• Utilize sequenciação do transcriptoma de células únicas para análise do hospedeiro ou sequenciação do transcriptoma de bactérias únicas.

Visão gráfica das abordagens baseadas em RNA-seq para estudar interações entre espécies no intestino mamífero. (Westermann et al., 2021)

Sequenciação de Metatranscriptoma

O sequenciamento do metatranscriptoma é utilizado para explorar as complexidades da estrutura e funcionalidade das comunidades microbianas. A obtenção de uma quantificação precisa da expressão génica dentro do microbioma requer um processo meticuloso. Para simplificar, metagenómico e metatranscriptómico os dados da mesma amostra são inicialmente processados de forma independente. Subsequentemente, metagenómico os dados são utilizados para normalizar dados metatranscriptómicos, resultando em valores MT/MG que encapsulam alterações na atividade de genes, espécies e funções.

Notavelmente, estudos sobre o microbioma intestinal descobriram um maior grau de variabilidade no metatranscriptoma comparado com o metagenoma. Esta observação implica que os micróbios exibem regulação ativa em resposta a mudanças no seu ambiente e condições nutricionais. As mudanças tanto na composição como na funcionalidade dos micróbios intestinais humanos têm sido ligadas a infecções por doenças. Por exemplo, a abundância de mRNAs microbianos intestinais que codificam proteínas envolvidas na defesa antioxidante e na homeostase de iões metálicos foi identificada como um correlato negativo com o risco de experimentar sintomas de febre tifóide após infecção com Salmonella typhimurium.

Sequência de RNA dual

O RNA-seq dual, uma abordagem inovadora, é utilizado na investigação das interacções entre patógenos e hospedeiros mamíferos a nível transcriptómico. Esta técnica de ponta permite a análise simultânea da expressão génica em organismos bacterianos e em células ou tecidos hospedeiros infectados, sejam eles intracelulares ou extracelulares. Através de sequenciação de RNA dual, pretendemos revelar complexidades anteriormente desconhecidas nas interações entre hospedeiros e micróbios, prometendo uma compreensão mais profunda dessas interdependências.

Os passos básicos em protocolos comumente utilizados para perfilagem de expressão específica de fitas em bactérias, mamíferos ou expressão dual. (Westermann et al., 2021)

Sequenciação do Transcriptoma de Célula Única (scRNA-seq)

Nos últimos anos, o avanço da tecnologia de sequenciação do transcriptoma de células únicas (scRNA-seq) deu início a uma nova era da transcriptómica, levando a numerosas descobertas significativas. Estas descobertas vão desde a identificação de tipos celulares e estados fisiológicos anteriormente desconhecidos até ao desvendamento de novas vias regulatórias de genes. Os investigadores começaram a reconhecer o papel fundamental da heterogeneidade celular nas interações hospedeiro-patógeno. Por exemplo, os patógenos exploram a heterogeneidade celular pré-existente e pré-induzida para estabelecer nichos ecológicos infecciosos.

Dentro da própria população de patógenos, existe uma diversidade fenotípica substancial. Por exemplo, Salmonella typhimurium exibe uma expressão bistável de genes invasivos mesmo antes de encontrar células hospedeiras, e essa diversidade na expressão gênica intensifica-se ao longo do curso da infecção. Esta estratégia oferece uma vantagem única - a invasão de certas subpopulações de Salmonela induz inflamação epitelial, que por sua vez facilita a invasão adicional de outros Salmonella typhimurium cepas no lúmen intestinal.

Para obter uma compreensão mais profunda destas dinâmicas intrincadas, abordagens transcriptómicas de maior resolução são imperativas. Estes métodos avançados permitem-nos capturar e dissecá-las de que forma a heterogeneidade celular influencia os resultados das interacções entre hospedeiro e micróbio.

Referência:

1. Westermann, Alexander J., e Jörg Vogel. "RNA-seq entre espécies para decifrar interacções hospedeiro-microbio." Nature Reviews Genetics 22.6 (2021): 361-378.