Investigação de Doenças Raras com Sequenciação do Exoma Completo

As doenças raras são aquelas com taxas de incidência extremamente baixas. Existem aproximadamente 7.000 doenças raras em todo o mundo, muitas das quais são genéticas. A investigação dessas doenças enfrenta desafios significativos devido aos seus sintomas diversos, mecanismos patogénicos complexos e à falta de tratamentos eficazes. Nos últimos anos, sequenciação do exoma completo A sequenciação do exoma completo (WES), uma tecnologia de sequenciação genómica de alto rendimento, tornou-se uma ferramenta importante para a investigação de doenças raras. Este artigo irá explorar as aplicações e vantagens da sequenciação do exoma completo na investigação de doenças raras.

I. Contexto Técnico e Vantagens Principais

WES identifica rapidamente mutações patogénicas ao direcionar-se para aproximadamente 1% das regiões exónicas (fragmentos de ADN que codificam proteínas) no genoma, utilizando tecnologia de sequenciação de alto débito. Comparado a sequenciação do genoma completo (WGS), o WES é menos dispendioso (aproximadamente 1/10 do custo do WGS), oferece uma análise de dados mais eficiente e cobre mais de 85% das mutações patogénicas conhecidas. As suas principais vantagens são:

• Localização altamente eficiente de genes patogénicos: Ao comparar variações de exões entre pacientes e indivíduos saudáveis, combinadas com filtragem bioinformática (como a exclusão de variações comuns e a triagem de mutações funcionalmente danosas), os genes associados a doenças raras podem ser rapidamente identificados. Por exemplo, o gene patogénico DHODH para a síndrome de Miller foi descoberto em quatro pacientes utilizando WES.
• Adequado para estudos com amostras pequenas: A análise de ligação tradicional requer um grande número de amostras familiares, enquanto o WES apenas necessita de alguns pacientes para descobrir novos genes patogénicos, reduzindo significativamente o limiar de investigação.
• Suporte para análise multidimensional: A combinação de dados de transcriptoma e epigenómica pode revelar mecanismos regulatórios complexos (como o impacto das variações em regiões não codificantes na splicing).

II. Casos de Aplicação Clínica

Caso 1: Análise WES de 58 Crianças Criticamente Doentes

1. Tecnologia Central: Detecção Combinada de CNVs e SNVs

O WES não só deteta SNVs, mas também identifica CNVs utilizando ferramentas de bioinformática, alcançando uma captura abrangente de variantes patogénicas em doenças raras.

• Deteção de CNVs: O WES identificou duas CNVs patogénicas novas (deleção 7q36.3 + duplicação 18q12.1q23 no paciente P9 e deleção 20q13.13 no paciente P10). A validação por CMA confirmou a envolvência de genes de haploinsuficiência do ClinGen (como SHH e ADNP), explicando fenótipos como micrognatia, atraso no desenvolvimento e hipertelorismo, nenhum dos quais havia sido relatado anteriormente.
• Deteção de SNV: Foram encontrados SNVs patogénicos/provavelmente patogénicos (P/LP) em 25 dos 58 pacientes (43,1%), envolvendo 24 genes (incluindo 23 SNVs novos), incluindo heterozigotos compostos (11 casos), homozigotos (2 casos) e variantes recessivas ligadas ao X (1 caso). Por exemplo:
  • As variantes heterozigóticas complexas do gene ACAT1 (P14/P15) causam acidose metabólica severa;
  • As variantes heterozigóticas do complexo do gene COG4 (P21) causam um distúrbio congénito de glicosilação (tipo IIj);
  • As variantes patogénicas do gene TOR1A (P8) estão associadas a tumores cerebrais e falência respiratória.

2. Saída Diagnóstica: Melhorar a Taxa de Diagnóstico e a Expansão Fenotípica de Doenças Raras

• Taxa de Diagnóstico Global: De 58 pacientes, 27 (56,9%) apresentaram resultados genéticos, e 25 (43,1%) receberam um diagnóstico genético definitivo, com uma taxa de diagnóstico cumulativa significativamente superior aos métodos tradicionais.
• Poder Explicativo Fenotípico: Em 72,7% dos pacientes com achados genéticos (24/33), o genótipo pôde explicar o fenótipo principal (por exemplo, a variante COG4 em P21 explica a icterícia e a epilepsia; a variante ACAT1 em P15 explica a acidose metabólica), enquanto apenas 6 casos (18,2%) apresentaram fenótipos parcialmente explicados pelo genótipo (principalmente sobrepostos a infeções severas).
• Distribuição de Doenças: Envolve doenças raras em múltiplos sistemas, incluindo distúrbios metabólicos (ACAT1, PNPO), distúrbios do neurodesenvolvimento (COG4, WDR73), imunodeficiência (SH3KBP1) e anomalias esqueléticas (IQCE). Infeções graves (pneumonia, sepsis, infeção cerebral) são sintomas acompanhantes comuns (70,4% dos pacientes com doenças genéticas têm infeções concomitantes, com uma taxa de mortalidade de 68,4%).

3. Valor Fundamental: Análise Complexa de Genótipos e Descoberta de Novos Genes

• Identificação de Genótipos Complexos: O WES corrige erros de julgamento na análise tradicional de SNV. Por exemplo, o paciente P8, com base numa grande deleção do cromossoma X (quase abrangendo o braço p/q) e na análise de SNV, foi presumido ter síndrome de Turner (45,X), e uma variante patogénica TOR1A foi descoberta. Onze pacientes com o gene AR foram identificados como pseudohomozigóticos através da análise de heterozigose complexa CNV+SNV (por exemplo, SNV do gene PNPO + duplicação causando epilepsia).
• Variantes novas e expansão fenotípica: foram descobertos 23 novos SNVs (15 genes) e 2 novos CNVs, expandindo as associações gene-fenótipo para 19 doenças raras. Por exemplo:
  • A duplicação do gene SH3KBP1 (P9) sugere uma associação entre a imunodeficiência ligada ao X-61 e anomalias neurodesenvolvimentais;
  • A deleção do cromossoma 4 (P11) apoia o papel da região 4p14-p13 no neurodesenvolvimento (Liu J et al., 2021).

Diagrama de fluxo da seleção de pacientes e descobertas genéticas no estudo (Liu J et al., 2021)

Caso 2: Aplicação do WES na Hipofosfatasia

(1) Diagnóstico e Classificação da HPP

Deteção Direta de Variações do Gene ALPL: Em três pacientes (Caso 1, 2 e 3), a WES verificou variações heterozigóticas do gene ALPL (por exemplo, c.1447G>A/p.Val483Met, c.205G>A) descobertas por Sequenciação de SangerCombinado com fenótipos como baixa atividade de TNSALP (TSALP) e malformações esqueléticas, foi diagnosticada HPP (infantil ou leve).

(2) Identificação de Doenças Genéticas Complexas

• Descoberta de Variações Cosegregantes: No Caso 1, a WES descobriu uma variação heterozigótica do gene SMC1A (c.3470del) com base nas variações do ALPL, explicando os fenótipos sobrepostos do paciente, como epilepsia e atraso no desenvolvimento (HPP e epilepsia desenvolvimental 85 cosegregaram); no Caso 2, a WES descobriu uma variação homozigótica do gene WNT10A (c.682T>A), sugerindo uma potencial associação entre anomalias no desenvolvimento ectodérmico e o fenótipo HPP.
• Correção de um erro de diagnóstico de um único gene: No Caso 6, o paciente foi inicialmente suspeito de ter HPP (baixo TSALP). O WES não encontrou variantes do ALPL, mas detetou uma variante homozigótica do gene SLC5A1 (c.1946G>A), confirmando a má absorção de glicose-galactose (GGM). Os sintomas melhoraram através de intervenção dietética (remoção de lactose/glicose/sacarose), evitando um tratamento ineficaz para HPP.

(3) Diagnóstico diferencial na ausência de variantes ALPL

• Voltando a outros genes patogénicos: No Caso 4 (sem variante ALPL detetada), o WES encontrou variantes heterozigóticas (VUS) dos genes TRIO (c.5651A>C) e TRPV4 (c.880T>G), sugerindo uma ligação potencial entre o neurodesenvolvimento e o metabolismo ósseo anormal; no Caso 5, foram detetadas variantes do gene TTN (c.32078-1G>T, c.47720_47721del), apontando para a miopatia de Salih (miopatia congénita tipo 5).
• Valor clínico dos resultados negativos: No Caso 7, a WES não detectou variações nos genes ALPL e outros. Combinado com uma análise fenotípica aprofundada (características faciais, história intrauterina), foi confirmada a diagnóstico de síndrome do álcool fetal, esclarecendo a causa não hereditária e evitando testes excessivos (Glotov OS et al., 2024).

Dinâmica dependente do tempo das flutuações dos resíduos de aminoácidos para as proteínas WNT10A do tipo selvagem e Phe228Ile mutadas (Glotov OS et al., 2024)

Aplicações do Sequenciamento do Exoma Total (WES) em Doenças Renais Hereditárias Extremamente Raras

1. Superar as limitações da análise de painéis genéticos para detectar doenças extremamente raras.

Os painéis genéticos direcionados cobrem apenas 20-100 genes conhecidos de doenças hereditárias dos rins, enquanto o WES cobre todo o exão, permitindo a deteção de doenças extremamente raras não incluídas nos painéis (como a síndrome renal nas famílias 5-7 e 9, hipercalcemia infantil tipo 1, etc.), evitando tempos de diagnóstico prolongados e custos devido a omissões nos painéis.

2. Identificação de variantes patogénicas inesperadas e validação da associação "genótipo-fenótipo"

A WES diagnosticou doenças inesperadas (como a síndrome de Ayme-Gripp causada pela mutação MAF na família 3, e a displasia torácica de costelas curtas tipo 9 causada pela mutação IFT140 na família 4). Através do paradigma genótipo-fenótipo de "informação clínica + sequenciação do genoma", verifica a total responsabilidade da variante pelo fenótipo (por exemplo, a mutação MAF explica deformidades faciais, perda auditiva e envolvimento renal; a mutação IFT140 explica displasia esquelética e insuficiência renal terminal de início precoce).

3. Orientação da Intervenção Precisa e Previsão Prognóstica

• Interpretação Fisiopatológica: Por exemplo, na família 2, a deficiência de APRT (variante homozigótica sem sentido) indica claramente uma produção excessiva de 2,8-dihidroxiadenina, levando à formação de cálculos renais, necessitando de inibidores da xantina oxidase e de uma dieta restrita em ureia;
• Ajuste de Tratamento: Na família 8, a mutação heterozigótica do complexo TRPM6 causa hipomagnesemia, exigindo ajuste na suplementação de cálcio e magnésio (descontinuando o cálcio e aumentando o magnésio);
• Decisão de Transplante: Na família 1, ADTKD-UMOD (variante missense do UMOD), é selecionado o transplante renal de um descendente não afetado;
• Monitorização Prognóstica: Na família 4, a SRTD 9 (variante IFT140) requer monitorização regular da função hepática, progressão óssea e descolamento da retina.

Com base na sequenciação do exoma completo e na patogenicidade, foram apresentadas as genealogias de nove famílias (Jung J et al., 2021)

III. Desafios Técnicos e Soluções

Complexidade da Análise de Dados

• Desafio: Os dados de WES requerem o processamento de milhões de variantes, tornando difícil distinguir entre variantes patogénicas e benignas.
• Solução:
  • Assistência em Aprendizagem de Máquina: Ferramentas como o FABRIC GEM, ao integrar dados multi-ómicos, melhoram a eficiência de triagem de genes candidatos para uma média de 2 genes/caso.
  • Validação Funcional: Combinação de modelos animais (por exemplo, edição CRISPR) e experiências com organoides para validar o impacto das mutações na função da proteína.

Gargalos na Tradução Clínica

• Desafio: A patogenicidade de algumas variantes ainda é incerta, e a heterogeneidade fenotípica deve ser considerada.
• Solução:
  • Anotação Padronizada: Referindo-se às diretrizes da ACMG, combinando bases de dados populacionais (por exemplo, gnomAD) e ferramentas de previsão funcional (por exemplo, PolyPhen-2) para avaliação hierárquica.
  • Colaboração Multicêntrica: Estabelecimento de bases de dados de doenças raras (por exemplo, o "Projeto Huabiao") para partilhar dados sobre a frequência de variantes e fenótipos clínicos.

Questões Éticas e de Privacidade

• Desafio: Como fornecer feedback aos pacientes sobre descobertas secundárias (por exemplo, estado de portador em adultos).
• Solução: Desenvolver diretrizes éticas, esclarecer o consentimento informado antes dos testes e fornecer apoio em aconselhamento genético.

IV. Direções Futuras de Desenvolvimento

• Integração de Tecnologia: Combinando sequenciação de leitura longa (tais como PacBio) para analisar variações estruturais complexas e melhorar a precisão do diagnóstico.
• Monitorização Dinâmica: Acompanhamento da progressão da doença através de biópsias líquidas para orientar o tratamento personalizado.
• Desenvolvimento de Fármacos: Design de inibidores de pequenas moléculas ou terapias genéticas baseadas em alvos genéticos patogénicos, como intervenções metabólicas que visam a DHODH.

V. Conclusão

O sequenciamento do exoma completo tornou-se uma "ferramenta central" na investigação de doenças raras, desempenhando um papel crucial no diagnóstico, tratamento e investigação básica devido à sua alta eficiência e precisão. Com a diminuição dos custos tecnológicos e a integração de multi-ômicas, espera-se que atinja "um teste para múltiplos usos" no futuro, impulsionando as doenças raras de "incuráveis" para "intervenção de precisão."

Referências

1. Liu J, Zheng Y, Huang J, Zhu D, Zang P, Luo Z, Yang Y, Peng Y, Xiao Z, Zhu Y, Lu X. Expansão dos genótipos e fenótipos para 19 doenças raras através de sequenciação do exoma realizada na unidade de cuidados intensivos pediátricos.. Hum Mutat. 2021 Nov;42(11):1443-1460.
2. Glotov OS, Zhuchenko NA, Balashova MS, Raspopova AN, Tsai VV, Chernov AN, Chuiko IV, Danilov LG, Morozova LD, Glotov AS. Os Benefícios do Sequenciamento de Exoma Total no Diagnóstico Diferencial da HipofosfatasiaInt J Mol Sci. 31 de outubro de 2024;25(21):11728.
3. Jung J, Lee JH, Park YS, Seo GH, Keum C, Kang HG, Lee H, Lee SK, Lee ST, Cho H, Lee BH. Doenças renais ultra-raras diagnosticadas com sequenciação do exoma completo: Utilidade no diagnóstico e gestãoBMC Med Genomics. 3 de julho de 2021;14(1):177.