PacBio HiFi vs Nanopore vs Illumina: Como Escolher a Plataforma de Sequenciamento Certa

Se alguma vez despejou centenas de gigabases num projeto e ainda assim acabou com uma montagem fragmentada, variantes ambíguas ou um monte de contigs em que não confia totalmente, não está sozinho. Em muitos estudos de genómica e metagenómica, o estrangulamento não é "mais dados" — é escolher o tipo de dados que corresponde à questão biológica.

Este guia compara PacBio HiFi, Oxford Nanopore (ONT) e Illumina de uma forma orientada para a decisão. Em vez de começar com uma longa história técnica, vamos focar no que realmente altera os resultados: as compensações entre comprimento de leitura e precisão, o que os estudos comparativos mostram quando o mesma amostra é sequenciado em diferentes plataformas, e qual plataforma (ou híbrida) tende a vencer na montagem de metagenomas (MAGs), variantes estruturais (SVs) e transcriptómica.

01 Porque a Escolha da Plataforma Altera os Seus Resultados

As plataformas de sequenciação não são intercambiáveis. A plataforma influencia:

• Como as repetições são bem resolvidas (e se as montagens quebram nos mesmos locais teimosos).
• Quão confiante pode ser em variantes pequenas (SNVs/indels) em comparação com rearranjos maiores (SVs).
• Se consegue separar estirpes intimamente relacionadas em metagenomas em vez de as colapsar numa consensual.
• Quer sejam isoformas reconstruídas ou inferidas indiretamente.

Uma boa forma de enquadrar a escolha da plataforma é perguntar: Que erro posso tolerar?

• Se precisar principalmente de chamadas de base altamente precisas em grande escala, a Illumina muitas vezes parece sem esforço.
• Se precisar de continuidade de longo alcance em repetições ou regiões complexas, as leituras longas são importantes.
• Se precisar de leituras longas e precisão (por exemplo, metagenómica a nível de estirpe, montagens de alta confiança, certas aplicações de SV), o HiFi tende a mudar o que é possível.

Fluxo de decisão para escolher Illumina, ONT ou PacBio HiFi.

02 Illumina, ONT e HiFi: Três Plataformas, Três “Personalidades”

Um modelo mental simples (e sim, é um pouco metafórico, mas é útil):

• Illumina é como um microscópioextremamente afiado, mas vê o mundo em pequenos azulejos.
• ONT é como um dronepode voar através de enormes paisagens genómicas, mas as versões iniciais eram "desfocadas", e mesmo hoje a precisão depende fortemente da química e da chamada de bases.
• PacBio HiFi é como um arquiteto cuidadoso: menos, peças mais longas do que a Illumina, mas as peças são precisas o suficiente para se encaixarem de forma limpa.

Tabela 1. Comparação prática (o que geralmente importa em projetos reais)

Os valores abaixo são intervalos típicos e variam conforme o instrumento, a química, a qualidade da biblioteca e a configuração da corrida. Utilize-os como orientação, não como especificações fixas.

Se quiser uma introdução rápida às tecnologias principais, estes recursos da CD Genomics são úteis:

• Noções básicas sobre a Illumina: Princípios e Fluxo de Trabalho do NGS da Illumina
• Visão geral da PacBio: Sequenciação SMRT da PacBio
• Visão geral do nanopore: Serviços de Sequenciação por Nanoporos e Visão Geral

03 O Que os Estudos Comparativos Mostram (Mesma Amostra, Resultados Diferentes)

As folhas de especificações não podem dizer-lhe o que acontece quando os genomas são confusos, as comunidades estão misturadas e as repetições estão por toda a parte. É por isso que os estudos comparativos são valiosos: eles mostram como as características da plataforma se traduzem na continuidade, correção e interpretabilidade da montagem.

Diferenças de resultados em alto nível quando a mesma amostra é sequenciada em três plataformas.

Uma comparação recente de metagenómica torna as compensações muito concretas.

Num estudo de 2025 focado em genomas montados a partir de metagenomas (MAGs), os autores compararam montagens produzidas a partir das mesmas amostras usando Illumina, ONT e PacBio HiFi, e depois avaliaram a fidelidade usando genomas isolados como referências (Deng et al.). A principal conclusão não é que "uma plataforma vence sempre" — é que cada plataforma falha. diferentemente:

• Illumina frequentemente recupera mais MAGs, mas as montagens podem ser mais fragmentadas, especialmente em repetições e regiões partilhadas.
• ONT tende a melhorar a contiguidade em comparação com leituras curtas, mas erros a nível de base (dependendo da química/basecalling/polimento) podem aparecer em locos conservados e podem complicar comparações mais detalhadas.
• HiFi pode produzir MAGs de alta contiguidade e alta precisão, incluindo casos que se aproximam de genomas fechados/circulares em situações favoráveis—porque leituras longas reduzem a ambiguidade e a alta precisão reduz "diferenças falsas."

Uma forma útil de interpretar isto é: a Illumina é excelente a coletar muitos fragmentos precisos, a ONT é ótima em cobrir longas distâncias, e a HiFi é incomumente boa em fazer ambas as coisas ao mesmo tempo—com uma compensação entre custo e rendimento.

Por que "curto e perfeito" pode ainda ser pior do que "longo e preciso" na montagem.

É tentador assumir que a Illumina deve montar melhor porque a sua precisão por base é tão alta. Mas em metagenomas ou genomas ricos em repetições, o comprimento da leitura torna-se o fator decisivo para a correção. Leituras curtas muitas vezes não conseguem ligar de forma inequívoca repetições ou atribuir variantes estreitamente relacionadas à estirpe/haplótipo correto. Leituras longas fornecem o contexto que falta, e a alta precisão do HiFi ajuda a posicionar variantes sem introduzir confusão proveniente do ruído de erro.

Se a metagenómica é o seu principal caso de uso, uma revisão recente sobre o papel do HiFi na metagenómica oferece uma visão mais ampla de onde o HiFi tende a melhorar a resolução (Han et al.).

04 Escolher pelo Objetivo da Pesquisa (Metagenoma, SV, Transcriptoma)

Esta secção é o "núcleo da decisão." Escolha o objetivo que corresponde ao seu projeto e use-o como ponto de partida.

Adequação da plataforma por objetivos de pesquisa comuns em genómica e metagenómica.

4.1 Metagenómica e montagem de MAG (o "problema da fragmentação")

Se o seu objetivo é uma ampla análise—composição da comunidade, catálogos de genes, perfilagem funcional—o Illumina é frequentemente a base mais eficiente. Você obtém alta capacidade de processamento e quantificação fiável em grande escala.

Mas se o seu objetivo mudar para MAGs de alta qualidade, resolução a nível de estirpe ou montagens quase de referência, as leituras curtas começam a atingir os seus limites. É aí que as leituras longas se tornam mais do que um "bom ter".

Quando a Illumina é frequentemente suficiente

• Grandes quantidades de amostras
• Perfilamento de comunidades, abundância diferencial, catálogos de genes
• Estudos sensíveis ao orçamento onde a contiguidade não é o principal resultado.

Quando o ONT brilha

• Precisas de spans muito longos para ligar repetições ou elementos móveis.
• Você quer flexibilidade e iteração rápida (e pode investir em estratégia de polimento/cobertura)
• Está a explorar ambientes novos e quer um contexto de longo alcance rapidamente.

Quando o HiFi é a aposta mais forte

• Você se preocupa com a correção e a continuidade da montagem ao mesmo tempo.
• Você quer MAGs de alta confiança (menos erros de montagem, colocação mais forte de variantes)
• Você deseja uma melhor recuperação de genes conservados e uma genómica comparativa mais limpa.

Estratégias híbridas que costumam funcionar bem

• Illumina + HiFi: leituras curtas suportam amplitude e quantificação; HiFi suporta continuidade precisa.
• Illumina + ONT: leituras curtas para polimento/quantificação; ONT para escoramento de longo alcance e estrutura.

Na prática, os designs híbridos são menos sobre "qual é o melhor" e mais sobre "em que quer gastar o seu orçamento: cobertura, continuidade ou correção?"

4.2 Variantes estruturais (SVs) e regiões genómicas complexas

Os projetos SV são onde as diferenças de plataforma se tornam evidentes rapidamente, porque os SVs frequentemente estão em repetições, duplicações segmentares ou loci complexos que leituras curtas não conseguem atravessar de forma limpa.

A Illumina é forte em:

• Grandes coortes onde deseja triagem escalável e rentável.
• Pequenas variantes e estatísticas em escala populacional
• Alguns tipos de SV com algoritmos e profundidade adequados, mas com limitações em contextos repetitivos.

Leituras longas (ONT/HiFi) são fortes para:

• Inserções, rearranjos complexos, eventos mediado por repetições
• Interpretação de SV resolvida por haplótipos (faseamento)
• Resolução mais direta de pontos de interrupção e estrutura

Escolhendo entre ONT e HiFi para trabalho com SV pesado

• Se precisar de vãos ultra-longos para atravessar repetições massivas ou para construir montagens extremamente contínuas, a ONT pode ser convincente.
• Se precisar de chamadas de alta confiança com menos ambiguidades a nível base, o HiFi muitas vezes simplifica a interpretação porque reduz o ruído provocado por erros nas alinhamentos e assinaturas de variantes.

Se a descoberta de SV é um objetivo central do seu projeto, o sequenciamento do genoma completo é frequentemente a rota mais direta—veja Serviços de Sequenciação do Genoma Completo.

4.3 Transcritos (isoformas vs quantificação)

A transcriptómica é onde a "escolha da plataforma" pode realmente significar "duas perguntas diferentes."

• Se a sua principal saída é a quantificação da expressão génica em muitas amostras, o RNA-seq da Illumina continua a ser o padrão de referência.
• Se a sua principal saída é a estrutura de isoformas, padrões de splicing, transcritos completos ou arquitetura de transcritos complexa, as leituras longas tornam-se muito mais valiosas.

A Illumina tende a ser melhor para:

• Expressão diferencial em grande escala
• Altas contagens de amostras
• Quantificação custo-efetiva e robustez do poder estatístico

Leituras longas tendem a ser melhores para:

• Isoformas completas (reduzindo a dependência de inferências)
• Descoberta da estrutura do transcrito (novas isoformas, splicing complexo)
• Certas questões de fusão ou RNA longo onde a continuidade é importante.

Uma abordagem muito comum de "o melhor de dois mundos"
Utilize a Illumina para quantificação e adicione uma camada de leitura longa para a estrutura do transcrito.PacBio Iso-Seq fluxos de trabalho de estilo ou sequenciação de RNA por nanopore.

05 Restrições Práticas Que Muitas Vezes Decidem Por Si

Às vezes, a "melhor" plataforma no papel não é a melhor plataforma para sua amostra ou a logística do seu projetoEstas limitações frequentemente decidem o resultado mais do que as especificações técnicas.

Fatores práticos que comumente influenciam a escolha da plataforma.

Qualidade da amostra e da molécula (especialmente para leituras longas)

O sucesso da leitura longa depende fortemente de DNA de alto peso molecular (HMW) ou RNA intacto (para certos fluxos de trabalho). Se o seu DNA já estiver fragmentado, os objetivos de leitura ultra-longa podem colapsar rapidamente. Por outro lado, o DNA HMW bem preparado pode tornar as estratégias ultra-longas da ONT realistas e também pode melhorar o desempenho da biblioteca HiFi.

Orientação prática:

• Se as suas amostras forem limitadas, degradadas ou ricas em inibidores, estratégias de leitura curta podem ser mais robustas.
• Se a continuidade é central, invista cedo na extração/controlo de qualidade e trate isso como parte do design de sequenciação, não como um "passo de preparação."

Escala e rendimento do projeto

A Illumina é vantajosa quando precisa de capacidade de processamento em muitos amostras. Leituras longas também podem ser escaladas, mas normalmente planeia de forma diferente: menos amostras com maior densidade de informação, ou um design híbrido.

Pergunte:

• Precisa de muitas amostras ou da máxima resolução por amostra?
• Está a otimizar para descoberta (estrutura, montagem) ou estatísticas (quantidade entre coortes)?

Complexidade da bioinformática (e quanto você deseja gerir)

Todas as plataformas requerem bioinformáticamas os pontos de dor diferem.

• As pipelines da Illumina são maduras e padronizadas para muitas tarefas.
• Leituras longas muitas vezes introduzem mais escolhas: modelos de basecalling, estratégias de polimento, chamadores de SV ajustados ao tipo de leitura, parâmetros de montagem e métricas de QC que parecem diferentes.

Isso não significa que leituras longas são "difíceis"—significa que você deve reservar tempo e especialização para o design da análise, e não apenas para a sequenciação.

Realidades orçamentais e de cronograma

Os custos e o prazo de entrega dependem dos detalhes do projeto, mas o padrão de decisão tende a ser estável:

• A Illumina é geralmente a mais económica por base em termos de abrangência.
• HiFi tende a custar mais por base, mas pode reduzir a ambiguidade e o retrabalho a montante quando a precisão e a continuidade são ambas necessárias.
• A ONT pode ser flexível e rápida na iteração, mas os melhores resultados muitas vezes requerem um planeamento cuidadoso para precisão e aperfeiçoamento.

06 Resumo: Uma Forma Simples de Decidir

Se quiser uma regra de decisão curta que realmente funcione:

1. Comece com o resultado biológico que mais lhe interessa.
   Continuidade da montagem? Estrutura variante? Arquitetura de isoforma? Quantificação em grande escala?
2. Decida qual erro é inaceitável.
   Consegue tolerar a fragmentação? Consegue tolerar ruído a nível base? Ou precisa de continuidade e precisão?
3. Escolha uma única plataforma se se adequar; opte pelo híbrido quando não se adequar.
   Híbrido não é exagero—é muitas vezes a forma mais limpa de obter tanto amplitude como resolução.

Um resumo em linguagem simples

• A Illumina é a escolha certa para leituras curtas de alta capacidade e alta precisão—excelente para grandes estudos e quantificação.
• ONT é a opção de leitura longa flexível—excelente para abranger grandes estruturas e necessidades ultra-longas, com a precisão dependendo da química/decodificação/basecalling/estratégia de polimento.
• PacBio HiFi é a opção de leitura longa que enfatiza a precisão—frequentemente a forma mais direta de obter contexto de longo alcance sem pagar por isso em ruído de erro.

Se está a planear um projeto e deseja uma solução de ponta a ponta, a CD Genomics pode apoiar sequenciação Illumina de leitura curta, PacBio SMRT/HiFi e Oxford Nanopore—além de bioinformática para montagem, análise de SV e transcriptómica (veja Sequenciação SMRT da PacBio e Serviços de Sequenciamento Oxford Nanopore).

07 Perguntas Frequentes

O que é o sequenciamento PacBio HiFi?
A sequenciação PacBio HiFi (alta fidelidade) gera leituras longas com uma precisão muito elevada, lendo repetidamente a mesma molécula de DNA e construindo um consenso. É frequentemente escolhida quando é necessário um contexto de longo alcance sem comprometer a precisão das chamadas de bases.

Qual é melhor: PacBio HiFi ou Oxford Nanopore (ONT)?
Nenhum é universalmente "melhor" — depende do que você mais precisa. HiFi é uma escolha forte quando a precisão e montagens limpas são importantes, enquanto ONT é atraente quando longos vãos, flexibilidade ou execuções em tempo real são prioridades.

A Illumina ainda é a melhor escolha para a maioria dos projetos?
Para estudos em larga escala focados na quantificação de expressão, triagem de variantes ou abrangência custo-eficiente em muitas amostras, a Illumina continua a ser uma base prática. A principal limitação surge quando a sua questão chave depende de abranger repetições, resolver estruturas complexas ou construir montagens altamente contíguas.

A sequenciação por Nanopore pode ser tão precisa quanto a da Illumina?
Em muitos fluxos de trabalho, a precisão da ONT pode ser substancialmente melhorada com químicas atualizadas, chamada de bases e polimento, especialmente com cobertura suficiente. A decisão geralmente recai sobre se o seu projeto pode tolerar padrões de erro específicos da plataforma e os passos adicionais necessários para alcançar o seu objetivo de precisão.

Preciso de leituras longas para metagenómica e montagem de MAG?
Se o seu objetivo é principalmente o perfilamento de comunidades ou catálogos de genes em grande escala, leituras curtas são frequentemente suficientes. Leituras longas tornam-se muito mais valiosas quando você deseja MAGs de maior continuidade, separação de estirpes mais limpa ou melhor resolução em repetições e elementos móveis.

Qual é a melhor plataforma para a deteção de variantes estruturais (SV)?
Leituras longas geralmente tornam a deteção de SV mais direta porque podem abranger pontos de quebra e regiões repetitivas. HiFi é frequentemente preferido quando se deseja alinhamentos mais claros e chamadas de maior confiança, enquanto ONT pode ser útil quando spans muito longos são o fator decisivo.

Preciso de sequenciação de leitura longa para transcriptómica?
Nem sempre. Se o seu objetivo principal é a expressão diferencial entre muitas amostras, o RNA-seq de leituras curtas é tipicamente a abordagem mais eficiente; se você se preocupa com isoformas de comprimento completo, splicing complexo ou descoberta da estrutura do transcrito, adicionar leituras longas pode ser uma melhor opção.

Devo usar uma estratégia híbrida (Illumina + leituras longas)?
Os designs híbridos são frequentemente a forma mais simples de obter tanto amplitude como resolução—leituras curtas para escala e quantificação, leituras longas para continuidade e estrutura. Esta abordagem é comum quando as montagens, SVs ou estruturas de isoformas são importantes, mas os orçamentos ainda precisam de se manter eficientes.

Quanto DNA preciso para sequenciação de long-read?
Os requisitos de entrada dependem fortemente do tipo de biblioteca, organismo e se está a procurar leituras ultra-longas. Como regra, o sucesso das leituras longas beneficia de DNA de alta massa molecular e de um controlo de qualidade cuidadoso, por isso vale a pena planear a extração e o manuseio como parte do design de sequenciação.

Onde posso começar se já sei que preciso de PacBio ou Nanopore?
Pode usar estas páginas como pontos de entrada: Sequenciação SMRT da PacBio e Serviços de Sequenciação Oxford Nanopore.

Referências:

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