Sequenciação de Nova Geração (NGS) vs. PCR

O que é PCR?

A PCR, abreviatura de Reação em Cadeia da Polimerase, serve como uma ferramenta fundamental para detectar mutações conhecidas. Funciona identificando fragmentos específicos de DNA, discernindo assim se um gene sofreu mutação. Esta técnica imita o processo natural de replicação do DNA, embora em um ambiente controlado de laboratório. Com o tempo, a PCR evoluiu, dando origem a várias iterações para se adequar a diversas aplicações.

A primeira geração de PCR, conhecida como PCR qualitativa, utiliza instrumentos de PCR padrão para amplificar genes-alvo. A análise subsequente envolve eletroforese em gel de agarose para examinar o produto resultante.

Avançando o campo, a segunda geração introduz a PCR quantitativa fluorescente (qPCR). Esta técnica permite o monitoramento em tempo real dos produtos de amplificação através da incorporação de reagentes fluorescentes. Apesar da sua capacidade para quantificação relativa utilizando curvas padrão, a qPCR não consegue fornecer quantificação absoluta.

Outro avanço notável é o Sistema de Bloqueio de Amplificação de Mutação (ARMS), que utiliza primers específicos para amplificar sequências-alvo mutantes com precisão. Juntamente com a deteção por sondas e PCR quantitativa em tempo real com fluorescência, o ARMS permite a deteção de mutações raras com uma especificidade e sensibilidade aumentadas. No entanto, o seu alcance é limitado a tipos de mutações conhecidas, tornando-o incapaz de identificar mutações novas.

Princípios e Procedimentos da PCR

O processo de PCR envolve vários componentes fundamentais:

• Template de DNA: Isto refere-se ao DNA amostral que contém a sequência alvo.
• Polimerase de DNA: Utilizada para sintetizar uma nova cadeia de DNA complementar à sequência-alvo. As polimerases mais comuns incluem a polimerase de DNA Taq.
• Nucleotídeos: Estes são os blocos de construção, especificamente trifosfatos de desoxirribonucleotídeo (dNTPs) (A/T/C/G), essenciais para a construção da nova cadeia de DNA.
• Transcriptase Reversa: Na PCR de transcrição reversa (RT-PCR), a transcriptase reversa é crucial para converter o RNA da amostra em DNA complementar (cDNA).

Sequenciação de Sanger

Sequenciação de Sanger destaca-se pela sua capacidade de identificar diretamente tanto mutações conhecidas como desconhecidas, tornando-se um recurso valioso na análise genética. No entanto, a sua sensibilidade é notavelmente limitada quando se trata de detectar mutações no gene EGFR.

Este método envolve a leitura sequencial das bases de DNA ao longo de um trecho de aproximadamente 800 pares de bases, conferindo-lhe o status de padrão ouro tanto na sequenciação tradicional como na de nova geração. Notavelmente, a sequenciação de Sanger desempenhou um papel fundamental na conclusão do inovador Projeto Genoma Humano, que durou mais de 13 anos.

Na prática, o sequenciamento de Sanger envolve o design de primers direcionados a locais de mutação dentro de genes associados a doenças conhecidas, seguido pela amplificação por PCR para sequenciamento direto. Ao contrário da amplificação abrangente de exões, apenas o local de mutação específico ou uma porção próxima do exão requer amplificação. Apesar da sua utilidade, a sensibilidade do sequenciamento de Sanger é limitada; pode falhar em detectar mutações que ocorrem em frequências abaixo de 5%.

Sequenciação de Nova Geração (NGS)

NGS, ou Sequenciação de Nova Geraçãooferece um notável poder exploratório, gerando grandes quantidades de dados a partir de um único ponto de partida de DNA, permitindo assim um maior rendimento de amostras. Esta tecnologia de sequenciação de DNA, que se baseia nas metodologias de PCR e GeneChip, representa um avanço significativo em relação às técnicas de sequenciação tradicionais.

Enquanto o sequenciamento de primeira geração utilizava sequenciamento por terminação sintética, o NGS introduz terminações de terminação reversível, permitindo o sequenciamento em simultâneo com a síntese. O NGS funciona ao capturar etiquetas específicas, tipicamente marcadores moleculares fluorescentes, transportados pelas bases recém-adicionadas durante a replicação do DNA para determinar a sequência do DNA.

Também referido como Sequenciação Massivamente Paralela (MPS) ou Sequenciação de Alto Débito (HTS), o NGS destaca-se pela sua escalabilidade, rapidez e acessibilidade na análise de sequências genómicas ou de ácidos nucleicos parciais. Tem a capacidade de sequenciar milhões ou até bilhões de moléculas de DNA simultaneamente, revolucionando os esforços de sequenciação em grande escala.

NGS abrange dois tipos principais: sequenciação de leituras curtas e sequenciação de leitura longaA sequenciação de leituras curtas, caracterizada pela sua maturidade em precisão e custo-efetividade, encontra ampla aplicação em investigação básica e em aplicações clínicas. Por outro lado, a sequenciação de leituras longas, embora ainda esteja a passar por otimizações em precisão e custo, aborda as limitações da sequenciação de leituras curtas na deteção de variações estruturais em grandes fragmentos.

As vantagens do NGS incluem a sua capacidade de amplificar DNA através de reações de PCR em nanoscale, resultando em uma geração massiva de dados através de reações paralelas. A diminuição do custo de geração de dados democratizou o sequenciamento genético em grande escala, facilitando a pesquisa em nível populacional e melhorando as aplicações em diagnósticos clínicos, descoberta de medicamentos e rastreio de patógenos.

Tabela 1 NGS vs. PCR

Além disso, avanços como A tecnologia SMRT da PacBio e Sequenciação por Nanopore da ONT têm expandido as capacidades de NGS. A tecnologia da PacBio facilita a montagem de novo de espécies complexas, promovendo estudos de biodiversidade, enquanto o sequenciamento Nanopore da ONT, com a sua abordagem independente de PCR e comprimentos de leitura longos que excedem 4 Mb, melhora a deteção de variantes estruturais. Portátil NGS dispositivos expandem as aplicações de sequenciação desde laboratórios até ambientes de campo e até mesmo no espaço, alargando o alcance da investigação genómica e das suas aplicações práticas.

Escolhendo Entre NGS e qPCR: Fatores e Considerações

Determinar se utilizar NGS A qPCR depende de vários fatores, incluindo o tamanho da amostra, a extensão das sequências na região-alvo, restrições orçamentais e os objetivos do estudo. A qPCR geralmente é vantajosa quando se lida com um número limitado de regiões-alvo (≤20) e quando o objetivo do estudo é rastrear ou identificar variantes conhecidas. Por outro lado, o NGS surge como a escolha preferida na maioria dos outros cenários.

Em contraste com as abordagens tradicionais de testes iterativos, o NGS direcionado simplifica os processos ao permitir o sequenciamento simultâneo de múltiplos genes em várias amostras. Além disso, NGS oferece capacidades exploratórias superiores, facilitando a deteção de variantes novas. Assim, é frequentemente o método preferido para estudos que requerem uma visão genómica mais ampla ou esforços de sequenciação em grande escala.