A Sequenciação de Nova Geração (NGS) Revoluciona a Detecção de Patógenos

Nos últimos anos, a paisagem das tecnologias de sequenciação passou por uma transformação significativa, transitando de ambientes de pesquisa para o domínio dos laboratórios clínicos. Esta transformação foi catalisada por avanços tecnológicos rápidos e reduções de custos significativas. Apesar de uma multitude de microrganismos conhecidos por causar infeções humanas, as técnicas de diagnóstico prevalecentes apenas arranham a superfície, deixando uma vasta gama de patógenos não identificados. Este desafio persistente é ainda agravado pela contínua emergência de novos patógenos. Surge assim a sequenciação metagenómica de próxima geração (mNGS), uma abordagem abrangente e precisa para a deteção microbiana e caracterização taxonómica. Embora numerosos estudos e relatos de casos sublinhem a eficácia da mNGS em melhorar o diagnóstico, tratamento e acompanhamento de doenças infecciosas, obstáculos formidáveis ainda se colocam no caminho a seguir.

Por favor, leia o nosso artigo Aplicações da Metagenómica na Biotecnologia e Cuidados de Saúde.

Libertando o Poder da NGS

A evolução das tecnologias de sequenciação, desde os métodos de primeira geração até ao sofisticado domínio das tecnologias de sequenciação de próxima geração, também conhecidas como NGS ou sequenciação de alto rendimento, mitigou efetivamente os desafios de baixo rendimento que afetavam as técnicas iniciais. Desde o ano 2000, o advento das tecnologias de sequenciação massivamente paralela orquestrou uma revolução nas capacidades de sequenciação de alto rendimento. Quebras críticas, incluindo a sequenciação por pirofosfato, sequenciação química de terminadores reversíveis e ligadura e sequenciação de oligonucleotídeos suportados, catalisaram um aumento monumental no potencial de rendimento. Notavelmente, este progresso ocorreu juntamente com uma redução dramática nos custos de sequenciação, democratizando ainda mais o acesso a estas ferramentas de ponta.

A Promessa da Sequenciação de Longas Leituras

As tecnologias de sequenciação de longas leituras (Nanopore e PacBio Sequencing), também referidas como sequenciação de molécula única, são um testemunho da inovação. Em contraste com a NGS, estas tecnologias possuem a capacidade de detectar impressionantes dez nucleotídeos por segundo, culminando numa redução substancial no tempo de sequenciação. Para além da velocidade, estas tecnologias desbloqueiam o potencial de deduzir sequências de mRNA de comprimento total através das suas leituras ultra-longas. Uma característica extraordinária dos sequenciadores de longas leituras é a sua capacidade de sequenciar diretamente amostras brutas de DNA/RNA, eliminando a necessidade de amplificação por PCR. Além disso, apresentam uma abordagem imparcial em relação aos nucleotídeos CG e oferecem a deteção e recuperação diretas de informações de metilação. No entanto, apesar destas vantagens notáveis, a integração da sequenciação de longas leituras em aplicações clínicas permanece limitada devido à sua elevada taxa de erro e às restrições financeiras associadas.

Navegando o Caminho do Laboratório Úmido para o Laboratório Seco

A sequenciação de alto rendimento de patógenos requer um processo em duas etapas: experimentação em laboratório úmido e subsequente análise bioinformática. Os esforços em laboratório úmido abrangem o pré-tratamento de amostras, extração de ácidos nucleicos, construção de bibliotecas e, finalmente, sequenciação. Enquanto isso, a análise bioinformática em laboratório seco abrange tarefas como controle de qualidade de dados, eliminação de sequências humanas, comparação de sequências de espécies microbianas e análise de genes de resistência a fármacos ou de virulência.

Fluxo de trabalho da solução para patógenos. (Sam et al., 2021)

Revelando o Processo: Etapas Chave

• Coleta de Amostras: A precisão na coleta de amostras do local primário da infeção aumenta substancialmente as taxas de deteção.
• Pré-Tratamento de Amostras: Diferentes amostras necessitam de estratégias de pré-tratamento distintas—liquefação para escarro, desparafinação para amostras FFPE e homogeneização para tecidos. Técnicas como filtração, centrifugação diferencial, hidrólise enzimática de DNA e tratamento com reagentes de metilação mitigam a proporção de DNA humano nas amostras.
• Extração de Ácidos Nucleicos: Protocolos diferentes são necessários para a extração de DNA e RNA.
• Construção de Bibliotecas: A escolha dos métodos de construção de bibliotecas alinha-se com a plataforma de sequenciação e o propósito pretendido.
• Sequenciação: As principais plataformas de sequenciação de próxima geração, como as oferecidas pela Illumina e pela UW Genetics, dominam esta fase.
• Análise Bioinformática: A análise de dados brutos estabelece a base para a subsequente identificação de espécies e genes de resistência a antibióticos.
• Relato: Os resultados da análise facilitam a identificação de potenciais patógenos.

NGS: Revolucionando a Identificação de Patógenos

A sequenciação de genoma completo de próxima geração é um farol de progresso, permitindo a identificação rápida e abrangente de bactérias, fungos, vírus e parasitas. Esta abordagem elimina a necessidade de suposições a priori sobre o agente causador, proporcionando uma sensibilidade e precisão inigualáveis em comparação com os métodos convencionais baseados em cultura. A mNGS prova ser particularmente potente na identificação de micobactérias, anaeróbios, patógenos atípicos e vírus, demonstrando resiliência mesmo na presença de antibióticos. Este potencial para diagnóstico preciso e diagnóstico diferencial de doenças infecciosas foi validado através de uma variedade de estudos.

Em Conclusão

A jornada das tecnologias de sequenciação desde os corredores da pesquisa até à vanguarda do diagnóstico clínico foi impulsionada por saltos tecnológicos e reduções de custos. A sequenciação metagenómica de próxima geração (mNGS) representa uma mudança de paradigma, oferecendo uma estratégia holística e confiável para a deteção microbiana e perfilagem taxonómica. Embora as conquistas na utilização da mNGS para diagnóstico e gestão de doenças sejam notáveis, desafios formidáveis ainda aguardam resolução. Através da busca incessante pela precisão, a microbiologia clínica está pronta para redefinir o diagnóstico e tratamento de doenças infecciosas.

Referência:

1. Sam, Soya S., et al. "Avaliação de um ensaio de metagenómica de sequenciação de próxima geração para detectar e quantificar vírus de DNA no plasma de recipientes de transplante." The Journal of Molecular Diagnostics 23.6 (2021): 719-731.