Diretrizes para Submissão de Amostras
Perguntas Frequentes sobre Sequenciação Microbiana
Questões Gerais
- O que é a sequenciação da diversidade da comunidade microbiana?
- A identificação de populações microbianas envolve o sequenciamento de alto rendimento dos genes 16S rRNA bacterianos e dos genes 18S rRNA fúngicos, bem como das sequências ITS (Espaçador Interno Transcrito). O objetivo é caracterizar populações microbianas através do sequenciamento das regiões genéticas específicas. O termo "gene 16S rRNA" (gene 18S rRNA) refere-se às sequências de DNA correspondentes que codificam o rRNA ribossómico 16S (18S rRNA) nos genomas bacterianos (fúngicos). Estes genes incluem nove regiões hipervariáveis (V1-V9) e dez regiões conservadas. O ITS, que consiste em ITS1 e ITS2, está situado entre as regiões 18S e 5.8S e as regiões 5.8S e 28S, respetivamente, na sequência do gene rRNA ribossómico eucariótico. O sequenciamento destas regiões específicas fornece informações valiosas sobre as espécies microbianas e a sua abundância.
- Nos resultados analíticos fornecidos, a ausência de uma determinada espécie levanta a questão de saber se se pode concluir que a espécie está realmente ausente na amostra?
- Em teoria, a ausência de informação sobre uma espécie particular na amostra analisada implica a sua não existência nessa amostra. No entanto, dois cenários práticos podem afetar esta determinação. Em primeiro lugar, os primers de PCR utilizados podem apresentar viés, o que significa que a espécie pode estar presente na amostra (embora em baixa abundância), mas a amplificação por PCR falha, levando à sua não deteção na sequenciação subsequente. Em segundo lugar, a ausência de informação relevante sobre esta espécie na base de dados pode resultar na incapacidade de alinhar as sequências obtidas com informações sobre a espécie durante a análise, mesmo que a espécie esteja presente nos dados sequenciados.
- Relativamente ao desenho experimental do projeto de diversidade microbiana, por que é essencial incorporar replicados biológicos?
- A inclusão de réplicas biológicas é uma consideração crítica no design de projetos de diversidade, particularmente aqueles focados na análise diferencial. Em estudos que envolvem análise diferencial, tanto testes paramétricos como não paramétricos, como testes t e testes de soma de postos, são comumente utilizados. Independentemente do método de teste, cálculos envolvendo parâmetros como variância e média são integrais, e valores numéricos significativos só podem ser derivados quando réplicas biológicas estão presentes. Assim, do ponto de vista dos princípios de análise de dados, as réplicas biológicas são indispensáveis. Além disso, os fatores que influenciam amostras ambientais na pesquisa de diversidade são inerentemente complexos. Uma única amostra representando um grupo é insuficiente e gera resultados pouco fiáveis. A incorporação de réplicas biológicas adiciona significância estatística ao estudo, aumentando a sua fiabilidade face às influências multifacetadas sobre as amostras ambientais na pesquisa de diversidade.
- Quais são as diferenças entre réplicas biológicas, réplicas técnicas e amostras agrupadas?
- Para além dos estudos de diversidade, em designs experimentais convencionais, as distinções entre réplicas biológicas, réplicas técnicas e amostras agrupadas têm sempre sido considerações fundamentais que influenciam o design experimental. Vamos explorar as definições e a importância destes três conceitos.
Replicados biológicos, em termos simples, referem-se a diferentes amostras sujeitas ao mesmo tratamento. A inclusão de replicados biológicos visa validar conclusões gerais ao resumir os resultados de um conjunto de amostras e generalizar essas características para toda a categoria de amostras.
Os replicados técnicos são repetições de procedimentos técnicos introduzidos durante os experimentos para contabilizar possíveis erros ou desvios. Por exemplo, na sequenciação, realizar três corridas de sequenciação na mesma amostra de solo forma um conjunto de replicados técnicos, demonstrando a estabilidade da preparação da biblioteca e dos resultados da sequenciação dentro de uma faixa razoável.
Amostras agrupadas, como o nome sugere, envolvem a mistura completa de múltiplas amostras (geralmente em proporções iguais). Agrupar amostras serve para homogeneizar as diferenças entre as amostras individuais, proporcionando uma mistura mais representativa que melhor encapsula as características desta categoria de amostras.
Estes três abordagens de design de amostra podem ser utilizadas em combinação ou individualmente, dependendo dos objetivos da pesquisa. Para perguntas específicas, sinta-se à vontade para consultar a nossa equipa técnica.
- Para além dos estudos de diversidade, em designs experimentais convencionais, as distinções entre réplicas biológicas, réplicas técnicas e amostras agrupadas têm sempre sido considerações fundamentais que influenciam o design experimental. Vamos explorar as definições e a importância destes três conceitos.
- Diretrizes Comuns para a Coleta de Amostras Experimentais.
- Coleta de Amostras de Solo: Escolha uma área de solo representativa e utilize ferramentas estéreis para coletar uma quantidade especificada de solo a uma profundidade de 5-10 cm. Remova quaisquer impurezas, porcione, rotule e feche cada saco de amostra contendo aproximadamente 5-10g de solo. Armazene as amostras seladas imediatamente a baixas temperaturas.
Coleta de Amostras Fecais: Utilize dispositivos estéreis de coleta de fezes ou outros recipientes esterilizados para coletar amostras fecais. Porcione, rotule e armazene rapidamente as amostras a baixas temperaturas (alternativamente, rotule e armazene primeiro antes de porcionar). Para cada amostra, distribua em vários tubos de centrífuga estéreis, cada um contendo aproximadamente 0,2g. Nos casos em que as fezes individuais de camundongos forem insuficientes (<0,2g), os replicados biológicos podem ser combinados. Evite a exposição prolongada das amostras fecais ao ar para prevenir contaminação e degradação. Para amostras valiosas ou difíceis de coletar, é aconselhável criar cópias de segurança.
- Coleta de Amostras de Solo: Escolha uma área de solo representativa e utilize ferramentas estéreis para coletar uma quantidade especificada de solo a uma profundidade de 5-10 cm. Remova quaisquer impurezas, porcione, rotule e feche cada saco de amostra contendo aproximadamente 5-10g de solo. Armazene as amostras seladas imediatamente a baixas temperaturas.
- Os meus resultados de extração de ácidos nucleicos e controlo de qualidade da amostra ambiental não são satisfatórios. Posso ainda prosseguir com o sequenciamento de amplicões?
- A sequenciação de amplicons envolve a amplificação por PCR de regiões genómicas específicas para um determinado grupo de microrganismos. A verificação da qualidade do DNA é apenas uma parte da avaliação da qualidade, e a decisão de prosseguir com a sequenciação depende do relatório de controlo de qualidade da amplificação por PCR. Em casos onde a extração de ácidos nucleicos produz material limitado, mas é possível obter produtos de PCR com qualidade e quantidade suficientes, a sequenciação ainda pode ser realizada.
- O meu estudo foca-se em bactérias endofíticas e pretendo realizar projetos de amplicon/metagenómica. Quais são os riscos e que recomendações tem para as fases iniciais do experimento?
- Em primeiro lugar, considere se as bactérias endofíticas podem ser isoladas. Se o isolamento não for viável, existe um risco inerente de contaminação do tecido vegetal e animal na amostra. O risco potencial na sequenciação de amplicões reside na amplificação de sequências de cloroplastos vegetais e mitocôndrias animais. A sequenciação metagenómica pode resultar em contaminação substancial do hospedeiro, particularmente se o hospedeiro não tiver um genoma de referência. Nesses casos, a sequenciação de amplicões deve ser considerada como uma opção preferível.
- Recomendações Pré-experimentais:
- Para sequenciação de amplicões, é aconselhável realizar uma revisão da literatura para selecionar primers que excluam eficazmente as sequências de cloroplastos, avaliando assim a viabilidade do estudo.
Para sequenciação metagenómica, recomenda-se um teste preliminar num subconjunto de amostras. Isso permite compreender a proporção de componentes do hospedeiro (plantas e animais) e microbianos dentro das amostras. É essencial avaliar se os dados microbianos são suficientes para análises subsequentes. Se os dados microbianos forem insuficientes, pode-se considerar sequenciação adicional para alcançar um conjunto de dados analisável.
- Para sequenciação de amplicões, é aconselhável realizar uma revisão da literatura para selecionar primers que excluam eficazmente as sequências de cloroplastos, avaliando assim a viabilidade do estudo.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
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